3-ma’ruza Mikrobiologiya tadqiqotlarining asosiy usullari

Mikroorganizmlarning oqib turuvchi kulturasi. Bu usul laboratoriyada yoki ishlab chiqarish korxonalarida muhim ahamiyatga ega. Kulturali idishlarga doim yangi oziq eritmasi oqizib qo’yiladi. Ikkinchi tomondan ishlanib bo’lgan kultura chiqib turadi, ikkala tomonning oqim tezligi barobar bo’ladi. Masalan, kultivatorlar tutashtirilgan 3 ta idishdan iborat bo’lsa, 1 idishda yosh bakteriyalar, 2 idishda yetilgan bakteriyalar va uchinchi idishda ko’payishdan to’xtagan bakteriyalar kulturasi bo’ladi. Bu usulda istagan vaqtda ishni to’xtatib, ma’lum yoshdagi bakteriyalar kulturasini olib, ularning xususiyatini o’rganish mumkin.

Mikrobiologiya tadqiqodlarinining asosiy metodlari

1) Mikroorganizmlar bilan ishlashda rioya qilinadigan aseptika qoidalari
Tirik mikroorganizmlar populyatsiyasiga bakteriya kulturasi deyiladi. Laboratoriyada mikroorganizm kulturalari turli shaklda o’stiriladi (suyuq oziqa muxitlarida, agarli "qiyshiq agar” (“kosyak")larda (sterillangan agarli oziqa muhit ma’lum burchak ostida qiyshaytirilib qotiriladi), Petri likopchalaridagi qattik oziqa muxitlarida). Mikroorganizmlar kulturasi faqat bir turdan iborat bo’lsa u sof kultura deyiladi. Mikrobiologlar deyarli hamma vaqt sof bakteriya kulturalari bilan ish olib boradilar. Agar kultura bittadan ortiq mikroorganizmlar turini tutsa, u kultura aralash yoki iflos kultura deyiladi. SHuning uchun sof kulturalarning tozaligini saqlash mikrobiologlarning asosiy vazifalariga kiradi. Aks holda tadqiqodlarda olingan natijalar noto’g’ri bo’ladi. Mikroorganizmlarning atrof muhitda keng tarkalganligi tufayli ularning sof kulturalarga tushmasligini ta’minlash uchun muhofaza choralarini ko’rish muhim, ya’ni aseptika texnikasiga amal qilish lozim.
Demak, aseptika texnikasiga ko’ra, mikroorganizmlar sterillangan oziqa muxitida o’stiriladi va bu muxitni atrofdan mikrorganizmlar tushishidan muhofaza qiliinadi. Sof kultura oziqa muxitga ekilganda quyidagi aseptika texnikasi qoidalariga amal kilinadi: 1) sof kulturaga tegishi mumkin bo’lgan barcha buyumlar oldindan sterillanadi; 2)ozikli muxit sterillanadi; 3) ekish va qayta ekish vaktlarida kultura ifloslanishidan saklanishi uchun extiyot qilinadi. Buning uchun quyidagi choralar amalga oshiriladi: a) barcha idish va oziqli muxitlar tayyor bo’lishi bilan darxol sterillanadi; b) havodagi mikroblar tushmasligi uchun oziqli muxitlar yopiq idishlarda saqlanadi. Bunda paxta va dokadan tayyorlangan tiqinlardan foydalaniladi va ular faqat ekish vaktida olib turiladi, lekin hech qachon stol yoki boshqa buyumlarga qo’yilmaydi; v) sterillangan idishlarni ichki va ulardagi steril oziqli muhitlarga hamda sof kulturalarga tegishi mumkin bo’lgan barcha vositalar avvaldan sterillanadi, masalan, bakteriologik ilmok; g) ekish va kayta ekish vaqtida ishlatiladigan probirka va kolbalarni og’zi ishdan oldin flambirlanadi va iloji boricha kam vakt davomida ochiq holda qoldiriladi: d) ish joyini mikroorganizmlar bilan ifloslanishdan saqlanadi, bakterial ilmoqlar ishlatilgandan so’ng ham sterillanadi, pipetkalar esa dezinfektsiya qiladigan suyuqliklarga solinib ko’yiladi.
Laboratoriya sharoitida probirkadagi suyuq muhitdan boshqa probirkadagi muhitga ekish yoki Petri likopchasidagi agarli qattiq muhitga ekish kabi ishlar tez-tez amalga oshirilib turadi. Talabalar bunday mashg’ulotlarni bajarib, aseptika texnikasi qoidalarini amalda ko’llashni o’rganishlari lozim. Probirkadan probirkaga ekishda quyidagi ishlar bajariladi:
1. Mum qalam yordamida ekiladigan probirkalarga talabaning ismi, guruxini raqam soni yoziladi.
2. Ilmoq alanganing yuqori qismida cho’g’ holatigacha flambirlanadi va 10 daqiqa davomida sovutiladi, lekin stolga qo’yilmaydi.
3.CHap qo’l bilan kulturali probirka olinadi va ilmoq ushlagan qo’lni bo’sh barmoqlari bilan probirkani tiqini olinadi, lekin tiqin stolga qo’yilmay ushlab turiladi. Probirkaning og’zi alangada qisqa vaqt qizdiriladi.
4. Ilmoqdan foydalanib probirkadagi suyuqlikdan olinadi, bunda ilmoq probirkaning ichki tomoniga tegmasligi kerak.
5. Probirkani og’zi va tiqini alangada qizdirilib, probirka yopiladi va shtativga qayta qo’yiladi.
6. Bo’sh qo’l bilan ekiladigan probirka olinadi va yuqoridagidek ochilib, og’zi sterillash uchun qizdiriladi.
7. Ilmoqdagi suyuq kultura probirkaga asta solinadi so’ng aralashtiriladi.
8. Ilmokdagi tomchilarni probirkani ichida qoldirish uchun ilmoq probirkani ichidagi suyuqlik tugagan joyiga tegiziladi.
9. Ilmoq asta chiqariladi va probirkani og’zi bilan tiqin flambirlanadi, probirka yopiladi va shtativga qo’yiladi.
10. Ilmoq cho’g’ holatigacha qizdiriladi.
Probikadan Petri likopchasiga ekishda qo’yidagi ishlar amalga oshiriladi:
1. Petri likopchasining ustiga mum qalam yordamida talabaning ismi, guruhining raqam soni, sana yoziladi.
2. Yuqorida aytilganday, probirkadan ilmok bilan kultura solinadi.
3. Bo’sh qo’l bilan Petri likopchasining qopqog’i ochiladi, lekin stolga qo’yilmaydi va likopcha ustida ushlab turiladi.
4. Petri likopchasidagi oziqli muhitga ilmoqdagi kultura "shtrix" usulida ekiladi. Bunda agarni o’ymasdan extiyot qilib ekish lozim.
5. Petri likopchasi yopiladi.
6. Ilmoq flambirlanadi va joyiga qo’yiladi.Ekmalar 28 gradus0S da keyingi darsgacha o’stiriladi.
1). Yorug’lik va elektron mikroskoplprning bakterialarning tadqiq qilishdagi roli.
2). Prokariotlarning mikroskop ostida kuzatish: a) fiksirlangan, buyalgan preporat tayorlash. b) ezilgan tomchi usulida bakteriya preparatlarni tayorlash. v) bakterialarni boyitilgan va sof kulturalarini tayorlash. g) sterilizatsiya usullari.
Gramm usulida bo’yash va uning mikroorganizmlar klassifikatsiyasidagi ahamiyati. Mikroorganizmlarni mikroskop yordamida o’rganish metodlari.
Mikrobiologiyada mikroblarni bo’yashni oddiy va murakkab usullari mavjud. Oddiy bo’yash usullarida bir xil buyoqlardan, ya’ni suyultirilgan fuksin (1%10) buyogi, metil sinkasi va boshqalar qullaniladi. Murakkab bo’yash usulida 2-3 bo’yok ishlatiladi. Bu usul mikroblarning turli buyoq va reaktivlarga turlicha munosabatda bo’lishiga asoslangan.
Bu bo’yashning ahamiyati shundan iboratki, fiksasiya qilingan preparatlarning gension-violet bo’yog’i yod eritmasi bilan bo’yalgan va mustaxkam protoplazm bilan birikkan bo’lib, spirtda erimaydi. Ba’zi bakteriyalarning xujayrasi bo’yalganda u spirtda erib ketadi. Shuning uchun xam murakkab bo’yash usulida ikki-uch bo’yoq ishlatilib, mikroblarning turli bo’yoq va reaktivlarga turlicha munosabatda bo’lishiga asoslangan.
Gram usulida bo’yalganda,bo’yoqqa bo’lgan munosabatga qarab ikki xil, ya’ni Gram-musbat va Gram-manfiy bo’ladi.
A). Gram usulida bo’yalganda ba’zi mikroblar binafsha rangiga yakinroq bo’lib bo’yaladi. Bunday ranga bo’yaluvchi mikroorganizmlarni Gram musbat bo’yaluvchilar deyiladi.
B). Aksincha, ba’zi mikroblar Gram usulida fuksin rangiga, ya’ni och qizil rangga bo’yaladi, bu xilda och-qizilga bo’yaluvchi mikroorganizmlar Gram-manfiy bo’yaluvchilar deb ataladi.
Gram musbat va gram-manfiy bo’yalishning sababi mikrob tanasida ribonuklein kislotasining magniylik tuzi bor-yo’qligiga bog’liqdir. Mikroorganizmlarning tanasida ribonuklein kislotasining magniylik tuzi bo’lsa, unda mikrob gension-violet bo’yog’i bilan bo’yalganda ham u bo’yoqni o’z tanasida mahkam saqlab qoladi, preparatga spirt bilan ta’sir etilsa ham gension violet tusda bo’yalgan bo’ladi. Bu rangdagi mikroblarni Gram musbat dedik, gram manfiy bo’yaluvchi mikroorganizmlarda esa ribonuklein kislotasining magniyli tuzi bo’lmaydi. Shuning uchun unday mikroorganizmlar gension-violet bo’yog’ini tanasida mahkam saqlab qolaolmaydi, preparatga spirt bilan ta’sir etilganda gension-violet tusda bo’yog’i u xildagi mikroorganizmlarning tanasidan yuvilib ketadi, och-qizil rangga bo’yalib qoladi. Kuo’chilik sharsimon bakteriyalar achitqi nursimon zamburug’lar gram-musbat bo’yaladi. Ayrim tayoqchasimon bakteriyalar (kolibakteroid, karatid, brusellyoz va boshqa kasalliklarni quzg’atuvchilar) vibrionlar, spirillalar, risketsiyalar gram-manfiy bo’yaladi.
Sporalarni bo’yash. Buning uchun maxsus murakkab bo’yash usullari qullaniladi. Sporalarni bo’yash uchun uning qobigi yumshatilishi kerak, buning uchun yuqori temperaturadan, kislota, ishqor va boshqa moddalardan foydalaniladi. Bo’yalgan sporalar kislota va ishqor ta’sirida o’z rangini yo’qotmaydi. Sporalarni bo’yashni bir qancha usullari bor, ulardan Zlatogorev usuli eng ko’p qo’llaniladi. Fiksasiyalangan preparat ustiga filtr qogizi yopib, ustiga fuksin bo’yog’i qo’yiladi va alanga ustiga 5-10 minut to bug’ chiqkuncha qizdirilib bo’yaladi. Qog’oz olib tashlanib preparat 10 sekund 2 % li N ₂ SO ₄ ning eritmasi bilan rangsizlantiriladi va so’ngra suv bilan yuviladi. Preparat bir minut davomida metilen sinkasi bilan yaxshilab bo’yalib quritiladi va quriladi.
Zamonaviy mikroskoplar: yorug’ va qorong’i maydonli, faza — kontrast, lyuministsent va elektron mlkroskoplar. Biologik mikroskoplar imkoniyatlarining kimyoviy tavsifi.