|
54-rasm restiksion tahlil qilish Cheklov fermentlarining uchta asosiy klassi mavjud:
Birinchi turdagi cheklash endonukleazalari (masalan, Escherichia coli K12 dan olingan EcoR) o'ziga xos nukleotidlar ketma-ketligini tan oladi va o'zboshimchalik bilan shu ketma-ketlikdan unchalik uzoq bo'lmagan DNK molekulasini kesadi va kesilgan joyning o'zi qat'iyan ataylab qilinmaydi.
Ikkinchi turdagi cheklash endonukleazalari (masalan, EcoRI) ma'lum bir ketma-ketlikni tan oladi va DNK juft spiralini shu ketma-ketlik ichida aniq bir belgilangan nuqtada kesadi. Ushbu turdagi cheklash endonukleazalari markaziy o'qga ega bo'lgan va simmetriya o'qining ikkala tomonida teng o'qiladigan palindromal sekanslarni taniydi.
Uchinchi oraliq turdagi cheklash endonukleazalari (masalan, EcoPI) kerakli ketma-ketlikni taniydi va ikki qatorli DNK molekulasini kesib, ma'lum miqdordagi nukleotid juftlarini uning uchidan (yoki tanib olish joyidan turli masofalarda bir necha nuqtadan) chiqarib tashlaydi. Bunday holda, DNK fragmentlari to'g'ridan-to'g'ri (to'mtoq) uchlari bilan yoki chiqib ketgan (yopishqoq) 5'- yoki 3'uchlari bilan hosil bo'ladi. Ushbu cheklash fermentlari assimetrik joylarni taniydi.
55-rasm genlarni kiritilishi bo’yicha tahlili
Cheklovlar kichik va katta bo'laklarga bo'linadi. Kichkina bo'linadigan restriktiv fermentlar tetranukleotidni taniydi va oltita nukleotid juftligining ketma-ketligini tan oladigan katta bo'laklarga qaraganda ko'proq molekulalarga tanaffuslar kiritadi. Kichik bo'linadigan cheklash fermentlari - Hpa II va Alu (Arthrobacterluteusdan), katta bo'linadiganlar - Eco R I (Escherichiacoli dan) va Hind III.
Har bir cheklash fermenti uchun ishlab chiqaruvchi tomonidan berilgan tavsifda tavsiflangan maqbul reaktsiya sharoitlari mavjud. Asosiy o'zgaruvchilar inkubatsiya harorati va bufer tarkibi. Harorat rejimiga nisbatan qat'iy talablar qo'yiladi, tamponlar orasidagi farqlar esa shunchaki ahamiyatsiz.
DNKning cheklanishini tahlil qilish molekulyar biologik tadqiqotlar va amaliy tadqiqotlarda keng qo'llaniladi va DNKni o'rganishda eng muhim vositalardan biri hisoblanadi. Restriksion endonukleazalar yordamida siz turli xil viruslar, bakteriyalar, hayvonlar, o'simliklarning DNKlarini o'rganishingiz mumkin.
Qoida tariqasida, DNK dekolte mahsulotlari agaroz yoki akrilamid jelidagi gel elektroforezi yordamida tahlil qilinadi va natijada DNK fragmentlarini turli fermentlar uchun farq qiladigan ma'lum bir tasma to'plami shaklida ajratish tasviri cheklash tahlilining natijasidir. ma'lum bir DNKning.
Qisqa parchalar uzunroqlarga qaraganda tezroq ko'chib ketadi. Agarozning nisbatan yuqori konsentratsiyasida katta bo'laklar jelga umuman kira olmaydi. Migratsiya paytida taqiq parchalari buzilmaydi, ularni biologik faol ikki zanjirli molekulalar shaklida yuvish mumkin. Jellarni DNK bilan bog'lanadigan bo'yoqlar bilan bo'yashganda, ularning har biri cheklash qismiga to'g'ri keladigan, ularning molekulyar og'irligi ma'lum bo'lgan molekulyar og'irliklarga ega DNK yordamida kalibrlash orqali aniqlanishi mumkin bo'lgan bir qator to'plamlar paydo bo'ladi.
Bitta namunada bir nechta cheklash endonukleazlaridan foydalanilganda cheklash xaritalari tuzilishi mumkin. Ushbu ma'lumot bilan DNKda biologik muhim joylarni aniqlash mumkin. Cheklov xaritasi ma'lum bir nukleotidlar ketma-ketligining ma'lum bir mintaqada joylashganligini aks ettirgani uchun, ikki yoki undan ortiq turdosh genlar uchun bunday xaritalarni taqqoslash ular orasidagi homologiyani baholashga imkon beradi. Restrikt xaritalarini tahlil qilib, turli xil hayvon turlarining DNKning ayrim mintaqalarini ularning nukleotidlar ketma-ketligini aniqlamasdan taqqoslash mumkin. Masalan, odamlarda, orangutanlarda va shimpanzalarda gemoglobin zanjirlarini kodlovchi xromosoma mintaqalari so'nggi 5-10 million yil ichida deyarli o'zgarmaganligi aniqlandi.
Cheklov xaritasi o'chirish yoki qo'shish kabi katta genetik o'zgarishlarni ko'rish imkonini beradi. Bunday holda, taqiqlash qismlarining kamayishi yoki ko'payishi, shuningdek, cheklash joylarining yo'qolishi yoki paydo bo'lishi kuzatiladi.
Cheklash endonukleazalarining uchta klassi ajratilgan. Birinchi sinfga fermentlar kiradi (masalan, Escherichia coli K12 dan olingan EcoK), bu joyning o'ziga xos ketma-ketligini tan oladi, lekin o'zboshimchalik bilan DNK zanjirini sindirib tashlaydi (aftidan, DNK bilan kompleks hosil bo'lgandan keyin ferment o'ziga xos ravishda o'zaro ta'sir qilmaydi. uzoq DNK mintaqasi yoki DNK zanjiri bo'ylab harakatlanadi) ... Ikkinchi sinf fermentlarni (masalan, EcoRI) o'z ichiga oladi, ular DNKni tanib olish joyiga nisbatan aniq belgilangan nuqtada ajratib turadi. Uchinchi sinf oraliq turdagi fermentlarni o'z ichiga oladi (masalan, EcoPI), ular tanib olish joyidan turli masofalarda bir necha nuqtalarda DNK zanjirini sindirib tashlaydi. Bunda DNK fragmentlari tekis (to'mtoq) uchlari bilan yoki chiqib ketgan (yopishqoq) 5'- yoki 3'-uchlari bilan hosil bo'ladi
Qiymat
Amaliy molekulyar biologiyada ko'pincha II darajadagi restriktiv fermentlardan foydalaniladi, aksariyat hollarda palindrom bo'lgan tanib olish joyi. Barcha II sinf cheklovlari Mg2 + ga bog'liq.
Restriksion endonukleazalar bakteriyalar hujayralari tomonidan hujayradagi DNKning tarkibini va faolligini tartibga solish uchun ishlatiladigan kompleks restriksiya-modifikatsiya tizimining bir qismidir.
1970-yillarda restriktiv fermentlarning kashf etilishi, DNKning sekvensiya usullarini ishlab chiqish bilan bir qatorda gen muhandisligi rivojlanishiga asosiy turtki bo'lib xizmat qildi.
Isosizizomerlar - bu bir xil ketma-ketlikni tanib olish uchun o'ziga xos xususiyatga ega bo'lgan, lekin ba'zida metillangan nukleotid qoldiqlari borligi bilan ajralib turadigan va shu ketma-ketliklarni bir xil joylarda kesib o'tadigan, cheklash endonukleazalarining juftlari. Masalan, cheklash fermentlari Sph I (CGTAC ^ G) va Bbu I (CGTAC ^ G) izosxizomerlardir. Belgilangan ketma-ketlikni tanib olish va o'ziga xos parchalanish uchun birinchi ajratilgan ferment prototip, boshqa barcha shu kabi cheklash fermentlari izosizomerlar deb ataladi.
Isosizizomerlar bakteriyalarning har xil shtammlaridan ajratib olinadi va shuning uchun har xil izosxizomerlar har xil reaktsiya sharoitlarini talab qilishi mumkin.
56-rasm genlarni boshqa tirik organizm genlariga kiritish jarayoni
Do'stlaringiz bilan baham: |
