Введение. Цель, задачи предмета

Цель работы: Ознакомление с технологическими схемами получения дрожжевой РНК и выделения изолированной “глобулиновой” фракции белка. В ходе выполнения работы студенты овладевают навыками выполнения технологических операций по экстракции, центрифугированию, осаждению в лабораторных условиях, а также знакомятся с методами контроля промежуточных и конечных продуктов.

Часть 1 . Выделение дрожжевой РНК

Ход работы
1. Подготовить установку к работе. Установка состоит из стеклянного реактора с мешалкой, рубашкой и обратным холодильником. Обогрев осуществляется подачей горячей воды из ультратермостата. При подготовке установки к работе необходимо:
а) подсоединить рубашку реактора к ультратермостату;
б) подсоединить мешалку и обратный холодильник;
в) проверить работу мешалки;
г) включить подачу холодной воды в обратный холодильник;
д) установить с помощью контактного термометра температуру воды 82÷83^оС;
е) включить подачу воды в реактор.
2. Взвесить 37 г сухих дрожжей. Приготовить 170 мл экстрагента (1,5 моль/л диаммонийфосфата), для этого рассчитать требуемое количество концентрированного раствора соли и воды. Концентрация исходного раствора соли задается преподавателем.
3. После прогрева термостата до требуемой температуры экстракции (80^оС) внести в реактор через свободное горло 37 г сухих дрожжей и 170 мл приготовленного экстрагента. Затем включить мешалку. Когда суспензия прогреется до требуемой температуры (80^оС), через обратный холодильник добавить 5 мл концентрированного раствора аммиака и начать отсчет времени экстракции (15 мин).
4. По истечении этого времени отключить подачу воды в обратный холодильник и рубашку реактора, отсоединить мешалку, термометр и холодильник, перелить содержимое реактора в коническую колбу или стакан и охладить до комнатной температуры.
5. Охлажденную суспензию по 25 мл разлить в центрифужные стаканы и отцентрифугировать при 6000 об/мин в течение 15 мин. Денуклеинизированную биомассу собрать в отдельный стакан и оставить для выполнения части 2 лабораторной работы. Полученный бесклеточный экстракт при необходимости отфильтровать через бумажный фильтр и поставить на 30 мин в холодильник, измерив его объем.
6. Измерить концентрацию нуклеиновых кислот в экстракте методом А.С. Спирина (см. Приложение 1). Пробу экстракта необходимо для анализа развести в 200 раз.
7. Провести осаждение РНК в ИЭТ. Для этого необходимо поместить в охлажденный экстракт электроды рН-метра и довести значение рН среды до 1,8÷2,0 раствором концентрированной соляной кислоты. Стакан с осадком поставить на 30÷40 мин в холодильник.
8. Осадок РНК отделить от надосадочной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Осадок промыть подкисленной водой, добавив по 10 мл последней в каждый центрифужный стакан. При необходимости промывные воды отделить центрифугированием (6000 об/мин в течение 5 мин).
9. Промыть осадок спиртом или ацетоном, добавив в каждый центрифужный стакан по 10 мл растворителя. Отработанный растворитель при необходимости отделить центрифугированием (6000 об/мин в течение 5 мин) и слить в сборник отработанного спирта (ацетона).
10. Осадок РНК высушить в центрифуге, включив ее на 20 мин при 1000 об/мин с открытой крышкой. Определить массу полученного осадка.
11. Измерить объем надосадочной жидкости, полученной в п. 8, и определить в ней концентрацию нуклеиновых кислот методом Спирина.
12. Навеску полученной РНК массой 200 г растворить в 0,1 н NaOH в мерной колбе на 25 мл. Определить содержание в препарате нуклеиновых компонентов по методу А.С. Спирина и белковых веществ по методу Лоури (см. Приложение 1). Для анализа по методу А.С. Спирина полученный раствор развести в 100 раз.
В работе необходимо рассчитать:
а) степень экстракции нуклеиновых компонентов:
Х_экст = [НК]_э V_э /(m A 100),
где [НК]_э – концентрация нуклеиновых кислот в экстракте, мг/л;
V_э – объем экстрагента, равный 175 мл (170 мл соли и 5 мл аммиака), л;
m – масса исходных дрожжей, мг;
А – содержание нуклеиновых кислот в дрожжах (% задается преподавателем).
б) степень осаждения РНК в ИЭТ:
Х_иэо = ([НК] V₁ - [НК]_н/о V₂)/[НК]_эV₁,
где V₁ – объем экстракта, л;
V₂ – объем надосадочной жидкости, л;
[НК]_н/о – концентрация нуклеиновых кислот в надосадочной жидкости, мг/л.