|
Приготовление агара
Для постановки реакции преципитации в агаре необходимо приготовить 1,5% раствор агара. Для этого 1,5 г сухого агара помещают в колбу, туда же добавляют 100 мл физиологического раствора. Колбу помещают на водяную баню и кипятят до полного растворения агара. В растворенный агар добавляют мертиолат в конечном разведении 1:10000.
Метод двойной диффузии в геле по Оухтерлони
В качестве пластинок для реакции применяют хорошо обезжиренные предметные стекла. На стекло ровным слоем разливают горячий агар (2 мл на стекло). Толщина слоя агара на стекле при этом равняется 1 мм. Стекла должны быть абсолютно гладкими, без царапин, и при разливании должны лежать на строго горизонтальной поверхности. В противном случае толщина слоя агара будет неравномерной, что может привести к искажению результатов.
После застывания агара пластинки помещают во влажную камеру. В качестве влажной камеры удобно использовать эксикатор с налитой на дно его водой (в воду следует добавлять антисептик). После застывания агара пластинки по одной вынимают из эксикатора и на поверхности каждой пластинки стандартными штампами выдавливают лунки, из которых затем с помощью водоструйного насоса отсасывают агар. Размеры штампов могут быть различными в зависимости от цели опыта.
В лунки пастеровскими пипетками с тонко оттянутыми концами наливают антигены и антисыворотки и пластинки возвращают в эксикатор. При этом следует иметь в виду, что пластинки с агаром, находясь вне влажной камеры, очень быстро подсыхают. Регистрация результатов реакции осуществляется через сутки после постановки опыта. При диффузии антигенов против антисыворотки в агаре образуются ограниченные зоны, в которых антисыворотки оказываются в оптимальных концентрациях. В этих зонах формируются линии преципитации. Перед постановкой опыта все антигены должны обязательно уравниваться по белку, так как разница в концентрациях антигенов может привести к ошибочным выводам.
Контрольные вопросы
Структура антител.
Что лежит в основе иммунологической специфичности?
В чем заключается феномен агглютинации? Области использования реакций агглютинации в практике.
В чем заключается феномен преципитации? Области использования реакций преципитации в практике.
РАБОТА 12. Реакция связывания комплемента
Комплемент – ферментная система, необходимая для осуществления лизиса клеток (гемолиз, бактериолиз и др.) после присоединения к ним специфических антител. Эта система имеется в кровяной сыворотке всех млекопитающих. Особенно активна система комплемента у морской свинки. В классической иммунологии сыворотка морской свинки чаще всего используется в качестве комплемента при постановке реакций бактериолиза или гемолиза. Сыворотка, прогретая при 56оС в течение 30 мин, лишается комплементарной активности.
Если к свежей сыворотке крови животного, иммунизированного чужеродными эритроцитами, добавить эритроциты этого же животного, то вскоре произойдет их агглютинация, а затем лизис (гемолиз). Гемолиз не произойдет, если эритроциты добавить не к свежей сыворотке, а к сыворотке, предварительно прогретой при 56оC в течение 30 мин. Однако при добавлении к такой прогретой сыворотке небольшого количества свежей сыворотки любого другого животного, даже относящегося к другому виду, агглютинированные эритроциты немедленно начнут лизироваться. Это явление связано с присутствием в сыворотке крови комплемента, который воздействует не на антиген сам по себе, а на комплекс антиген – антитело. Иначе говоря, специфические антитела как бы подготавливают соответствующий антиген к действию комплемента, сенсибилизируют его.
Система комплемента включает девять различных протеинов (факторов), некоторые из них состоят из комплекса протеиновых субъединиц. Девять основных протеинов обозначают символами С1, С2 и т.д., а полипептидные субъединицы С1 – С1q, C1r, C1s. Вся система представляет собой последовательную цепь ферментов, активация которой инициируется комплексом антиген – антитело. В активации участвуют ионы Ca2+ и Mg2+. Конечный продукт С9 осуществляет лизис клеток. Последовательность включения отдельных компонентов комплемента такова: антиген – антительный комплекс активизирует С3 компонент комплемента, далее С3С1, С2С3С4, , С5С6С7, С8С9, С9лизис. Основное звено – компонент С3, который относится к 2-глобулинам, его молекулярная масса около 180000, концентрация в сыворотке крови 1500 мкг/мл.
Инициирующим фактором является комплекс антиген – антитело, поскольку при его образовании молекулы IgM и IgG меняют свою конформацию так, что на Fc-фрагменте обнажается участок, взаимодействующий с компонентом С3 комплемента. В присутствии ионов Ca2+ С3 активизируется, активация передается на С1 фактор и включается весь каскад.
Реакция связывания комплемента является одним из наиболее чувствительных иммунологических методов. Поэтому знание природы и свойств комплемента – необходимое условие для тех, кто предполагает проводить иммунологические исследования.
Антитела иммунной сыворотки, вызывающие вместе с комплементом лизис клеток, были названы лизинами. Так как при этой реакции всегда необходимо присутствие комплемента, ее часто называют реакцией связывания комплемента, а антитела – комплементсвязывающими.
Реакция связывания комплемента протекает в две фазы:
первая фаза – антитело, встретившись с соответствующим антигеном, образует комплекс аниген – антитело;
вторая фаза – комплекс антиген – антитело адсорбирует из окружающей среды комплемент. При отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом образование комплекса антиген – антитело не имеет места и адсорбции комплемента не происходит. Если в среде содержится только один из компонентов комплекса, адсорбции комплемента также практически не произойдет и последний останется в жидкости.
Для определения наличия в среде свободного комплемента разработана специальная методика, в которой в качестве индикатора используют эритроциты, сенсибилизированные соответствующим антигеном – гемолизином (гемолитическая система). При наличии в среде свободного комплемента обработанные гемолизином эритроциты подвергаются легко наблюдаемому невооруженным глазом гемолизу. При отсутствии комплемента в среде взвесь сенсибилизированных эритроцитов сохраняет свой первоначальный вид
Реакция связывания комплемента может быть использована с диагностической целью:
если в руках исследователя имеется специфический антиген, можно определить в исследуемом материале (крови) присутствие специфического к нему антитела и на этом основании поставить диагноз;
если в распоряжении исследователя имеются специфические антитела (иммунные сыворотки), можно определить характер изучаемого антигена.
Реакция связывания комплемента может быть также использована для оценки титра и специфичности получаемых на животных иммунных сывороток, для изучения антигенной структуры различных тканей и органов, в исследованиях, посвященных сравнительному изучению антигенных свойств тканей различных животных и человека, и т.д.
Do'stlaringiz bilan baham: |
