Введение. Цель, задачи предмета

Ход работы
Гидролиз бензилпенициллина под действием иммобилизованного фермента проводят в стеклянном пятигорловом реакторе, снабженном водяной рубашкой, мешалкой, электродами и термокомпенсатором рН-метра. В рубашку реактора подают нагретую до 41С воду, в реактор вносят 100 мл дистиллированной воды, затем точную навеску – 5 г соли бензилпенициллина и включают мешалку. После полного растворения соли в раствор вносят 1 мл концентрированной ортофосфорной кислоты, 15 г гель-фермента и производят начальный отсчет времени. Момент внесения фермента считают началом времени гидролиза.
В течение гидролиза реакционную смесь активно перемешивают.
Гидролиз проводят при рН 7,5÷7,6, величина которого поддерживается добавлением в реакционную среду 12,5% раствора аммиачной воды. Каждые 15 мин необходимо записывать объем щелочи, пошедшей на подтитровку.
С течением времени скорость гидролиза уменьшается, в зависимости от активности фермента процесс заканчивается через 1,5÷2,0 ч. Окончание гидролиза определяется по установившемуся постоянному значению рН раствора.
Реакционную смесь выгружают из реактора, осадок отфильтровывают через плотный бумажный фильтр на воронке Бюхнера.
Измеряют объем гидролизата и переносят в коническую колбу. Содержимое колбы охлаждают током холодной воды или на водяной бане со льдом до 4÷8С.
Осветление охлажденного гидролизата проводят активированным углем марки “Б”, взятым из расчета 1 г угля на каждые 100 мл гидролизата. После внесения угля содержимое колбы перемешивают в течение 15 мин, затем уголь отделяют от гидролизата фильтрованием в воронке Бюхнера.
Фильтрат переливают в химический стакан и вновь охлаждают в токе холодной воды или на водяной бане с тающим льдом.
После этого стакан устанавливают на столик магнитной мешалки, вводят электроды и термокомпенсатор рН-метра и ротор мешалки. При включенной мешалке по каплям добавляют из бюретки 18÷20% соляную кислоту до тех пор, пока значение рН не достигнет 3,9÷4,1. В этом интервале значений начинают выпадать кристаллы 6-АПК.
Стакан с реакционной массой снимают с мешалки, переносят на водяную баню со льдом или холодильник, где выдерживают не менее 2 ч.
Полученный осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера и дважды промывают охлажденной до 4÷8С дистиллированной водой порциями, примерно вдвое большими объема полученного осадка.
Промытый осадок подсушивают на той же воронке Бюхнера и дважды промывают ацетоном порциями, примерно вдвое большими объема осадка.
Ацетон тщательно отсасывают, 6-АПК переносят в предварительно взвешенную тонкостенную чашку Петри.
Окончательное высушивание продукта производят в вакуум-сушильном шкафу при 45÷50С и остаточном давлении 2,5÷4,0 кПа до постоянной массы.
По окончании работы оценивают величину выхода 6-АПК в расчете на прогидролизованный бензилпенициллин. Для этого по химическому уравнению гидролиза бензилпенициллина и количеству израсходованной щелочи сначала находят число гидролизовавшихся миллимолей бензилпенициллина, затем определяют соотношение массы полученного осадка 6-АПК, пересчитанной на число ммоль, к количеству прогидролизованного бензилпенициллина (ммоль).
Для получения дополнительных количественных характеристик ферментативного гидролиза бензилпенициллина студентам может быть предложено уточнить величину выхода 6-АПК на основании результатов йодометрического определения 6-АПК или оценить величину константы Михаэлиса (Км) на основании анализа значений начальных скоростей ферментативной реакции гидролиза бензилпенициллина, протекающей в соответствии со следующей предполагаемой схемой превращения:

Для этого процесс гидролиза бензилпенициллина проводят дважды при одной и той же температуре, одном и том же количестве фермента, но при различном начальном содержании бензилпенициллина. Получают две кинетические кривые расходования бензилпенициллина, в которых определяют начальные скорости процесса его гидролиза (U_гi). В результате решения системы алгебраических уравнений относительно Км и 1/(k₂с_Е) находят численное значение константы Михаэлиса:
Км/{(k₂с_Е)∙[ БПц]о}+1/(k₂с_Е) = 1/U_гi,
где i=1, 2.
Км = (k_-1+k₂)/k₁