|
Mavzu: Tripsinda ishlov berib bir qavatli o’sadigan hujayralar tayyorlash.
O‘sayotgan tovuq homilalarining teri-muskul to‘qimasidan birlamchi tripsinlangan hujayra olish
9-11 kunlik tovuq homilalari ovoskopda qarab ko‘riladi. Qon tomirlari yaxshi ko‘ringan, harakatchan homilasi bor tuxum tanlanadi. Oddiy qalam bilan havo kamerasi va homilaning joylashishi belgilanadi. Tuxum po‘chog‘iga yod qo‘shilgan spirt surtilib so‘ngra yondiriladi.
Steril qaychi bilan havo kamerasining chegarasidan 2-3mm yuqoridan qirqiladi, po‘choq osti, xorionallantois parda yirtilib, homilaning bo‘ynidan tortib olingach steril Petri likopchasiga qo‘yiladi (46-rasm).
46-rasm.Hujayrani o‘stirish uchun tayyorlash sxemasi.
1-homilani chiqarish; 2-bosh inikesish; maydalash; 3-bir necha marta yuvish; 4-tripsinlash; 5-hujayra aralashmasini mizustiga qo‘yish; 6-sentrifugalash va tripsindan ajratish; 7- cho‘kmani oz miqdordagi muhit bilan qayta sentrifugalash va hujayrani sanash; 8-kerakli konsentratsiyaga etkazish; 9-hujayralarni matras va probirkalrga ekish; 10-termostatgaqo‘yish.
Homilaningboshi, qanotlari, oyoqlarivaichkiorganlariolibtashlanadi. Qolgan teri-muskul xaltasi steril bankaga solinib qaychi bilan 3-4 mm kattalikda qirqiladi.
Maydalangan to‘qima 2-3 marta Xenks eritmasi bilan yuvilib, shilim-shiq va qon elementlaridan tiniq suyuqlik hosil bo‘lguncha yuviladi va tozalangach tripsinlash uchun kolbaga quyiladi.
Kolbaga 0,15%-li tripsin eritmasi 35-370C qizdirilib quyiladi (to‘qimaning va tripsinning nisbati 1/3) so‘ngra steril magnitcha solinib magnitli aralashtirgichga qo‘yiladi (47-rasm).
Tripsinlash bo‘lib-bo‘lib bajariladi, har 3-5 daqiqada ajralib chiqqan hujayralar tripsin bilan birgalikda sentrifuga probirkalariga quyiladi va muz ustiga yoki muzxonaga hujayraga tripsin ta’sir qilmasligi uchun qo‘yiladi. Kolbalardagi qolgan massaga tripsinning yangi porsiyasi, pufak hosil bo‘lmasligi uchun magnitli aralashtirgich moslashtiriladi. Bu jarayon to‘qima to‘lasincha ariqlaguncha 3-5 marta takrorlanadi.
Tripsin eritmasida hujayra suspenziyasini tripsinlagach 1000 ayl/daq. 10 daqiqa sentrifugalanadi.
Cho‘kma ustidagi suyuqlik 370C bo‘lgan oziq muhitda aralashtiriladi va 3 qavat doka filtrdan o‘tkaziladi. Hujayralar yaxshi aralashtirilgach 1 ml olinib hujayralarning soni aniqlanadi.
Hujayralarni o‘stirishdagi muvaffaqiyat ko‘p jihatdan ekiladigan miqdorga bog‘liq. Hijayralar kam ekilganda uzoq vaqt inkubatsiyalanganda ham bir qavatli hujayra (monosloy) hosil bo‘lmaydi.
47-rasm.Magnitli aralashtirgich.
Juda katta miqdorda ekilgan hujayrada intensiv ravishda proliferatsiya kechib, hosil bo‘lgan qavat tez qariydi, spetsifik bo‘lmagan degeneratsiyaga uchraydi.
Hujayralarni sanash Goryaev torida bajariladi. 1ml hujayra aralasmasiga 0,1 N limon kislotasida tayyorlangan 0,1% kristallviolet eritmasidan teng miqdorda qo‘shiladi.
Kamera tayyor bo‘lgach hujayra aralashmasi bilan to‘ldiriladi va yadrosi va sitoplazmasi zararlanmagan barcha hujayralar sanaladi; aniq konturdagi hujayra guruhi bir hujayra hisobidan sanaladi. Ikki kameradagi hujayrani sanash tufayli o‘rtacha arifmetik son olinadi.
4 ml suspenziyadagi hujayralar soni (x)quyidagi formula bilan aniqlanadi: X=(Ax2x1000):0,9;
bu erda A-bir kameradagi hujayralarning o‘rtacha soni;
0,9 – Goryaev to‘rining hajmi, mm3;
1000- 1sm3 da mm3 soni;
2-qo‘shilgan bo‘yoq hajmida suyultirilgan suspenziyaning koeffitsienti.
Hujayralar sanalgach, oziq muhitda shunday hisobda suyultiriladi, demak 1ml da 700 mingdan to 1mln. gacha hujayra (tovuq fibroblastlari uchun) bo‘lsin.
Misol. Olingan 1ml hujayra suspenziyasida 4mln hujayra bo‘lsa, demak 100ml suspenziyada jami hujayralarning soni 400 mln. Ekish konsentratsiyasi 1ml ga 1mln hujayra. 100 ml hujayra suspenziyasiga 400 ml bo‘lguncha oziq muhitdan qo‘shiladi.
So‘ngra matras yoki probirkalarga quyiladi. Probirkalarga 1ml dan, 1000, 250, 100 ml hajmdagi matraslarga 100, 40 va 15 ml hujayra aralashmasi quyiladi. Matras va probirkalar steril rezina tiqin bilan (muhit ishqorlanib qolmasligi uchun zichlab yopiladi, va kul’turaning turi, sana yozib qo‘yiladi).
Probirkalarga mumli qalam bilan uzunasiga chiziq chiziladi, chiziqni yuqoriga qaratilgan holda 50 qiyalikda maxsus shtativga yotqizilib 370C termostatga joylashtiriladi. Har kuni mikroskopning kichik kattalashtirgichida hujayraning o‘sish jarayoni aniqlab boriladi. Agar hujayralarda proliferatsiya bo‘lmasdan yumaloq, donador, hujayra qora rangda qavat-qavat bo‘lib shishadan ajralib tursa bu esa muhitdagi zardobning zaxarli ta’siridan dalolat beradi. Proliferatsiyalanayotgan hujayra tiniq, sitoplazmatik o‘simtalar bilan birlashgan, bir qavatli plastdek o‘sadi. Hujayraning ko‘payish jarayonida moddalar almashinu-vining mahsuloti ajraladi, bunday oziq muhitning pH kislotali tamonga o‘tib muhitni sarg‘aytiradi. Bu esa hujayralarga yomon ta’sir ko‘rsatib, hatto hujayraning o‘lishiga sababchi bo‘ladi. Bunday muhit yangisiga almashtiriladi.
Tovuq fibroblastlari to‘lasincha bir qavatli hujayralarni (monosloyni) 36-48 soat ichida hosil qiladi. Birgina tovuq homilasidan 70-120 mln hujayra olinadi.
Tovuq fibroblastlaridan tayyorlanib o‘stirilgan hujayralar Aueski kasalligining virusi, parrandalarning o‘lat, n’yukasl kasalligi, parrandalarning gripp, Raus sarkomasi virusi va boshqa viruslar bilan ishlashda qo‘llaniladi.
Do'stlaringiz bilan baham: |
