Veterinariya virusologiyasi

37-rasm.Qo‘y homilasining o‘pkasidan tayyorlangan birlamchi o‘stirilgan hujayra.

Keyinchalik passaj qilish natijasida hujayraning shakli o‘zgarishi va so‘ngra o‘lishi mumkin. O‘stirilgan hujayralar 10 marta passaj qilingandan so‘ng chirmashib o‘suvchi to‘qimalarga o‘tish bosqichida bo‘ladi.

38-rasm. Buqaning testikulasidan tayyorlangan
birlamchi o‘stirilgan hujayra.

Chirmashib o‘suvchi to‘qima kultu’ralari - Bu hujayralar organizmdan tashqarida uzoq muddatgacha ko‘payish qobiliyatiga ega.laboratoriya sharoitida ularni saqlash uchun bir idishdan ikkinchi idishga ko‘chirib ekish tufayli saqlab, oziq muhit har doim yangisiga almashtirib turiladi.
O‘sishda yuqori aktivlikka ega bo‘lgan, ma’lum bir tartibda uzoq muddat ko‘chirib o‘tkazilgan birlamchi o‘stirilgan hujayralardan chirmashib o‘suvchi to‘qima kul’turalari tayyorlanadi. Yangi hujayra qatoridagi chirmashib o‘suvchi to‘qima kul’turalarini kelib chiqish mexanizmini hujayraning genetik o‘zgarishi natijasida yoki ayrim hujayralarni seleksiyalanishida- birlamchi tayyorlangan hujayra tarkibida bor bo‘lgan hujayra deb tushuntiriladi.
Chirmashib o‘suvchi to‘qima bir xil shaklda bo‘lib, o‘sishi hatto ayrimlari onkogen aktivlikka ham ega. Chirmashib o‘suvchi to‘qimaning onkogen aktivlikka ega bo‘lish xususiyati, viruslarni o‘stirib vaksina tayyorlash vazifasini cheklaydi.
Chirmashib o‘suvchi to‘qima hujayralarini sog‘lom hayvonlar to‘qimasidan yoki zararli shish to‘qimalaridan tayyorlash mumkin. Bularning ichida quyidagi qatordagi hujayralar keng ishlatiladi:
HeLa – (ayollar bachadonining bo‘yin qismi hujayrasidan, rak kasalligida);
Hep – 2 (odam qizil o‘ngachining karsinomasida) (39 rasm);
KB – (og‘iz bo‘shlig‘ning rakida);
BNK – 21 (yangi tug‘ilgan xomyakchalar buyragida);
PPES – (perevivaemaya pochka embriona svin’i) cho‘chqa homilasining o‘suvchi buyragi;
PPT (perevivaemaya pochka telyonka) chirmashib o‘suvchi cho‘chqa buyragi;
PPO (perevivaemaya pochka ovets) chirmashib o‘suvchi qo‘y buyragi;
TR (iz slizistoy traxei korov) sigir traxeyasining shilimshig‘i;
L (mishinie fibroblasti) sichqon fibroblastlari;
COS (iz serdsa obezyani sinomolgus) sinomol’gus maymunning yuragidan va boshqalar.
Chirmashib o‘suvchi emlanadigan hujayralarning bir qator afzallik tomonlari bor:
Ularni tayyorlash deyarli oddiy, mehnat va moddiy vositalar tejaladi;
Bu kul’turalarni oldindan latent virus yoki mikroflora borligiga tekshirish mumkin;
Klon liniyalari o‘sishi uchun standart sharoit bilan taminlaydi, birlamchi hujayralarda esa hujayralarning aralash populyatsiyasi mavjud.
Birlamchi kulturalarga nisbatan ko‘pchilik chirmashib o‘suvchi hujayralar viruslarga keng spektrda sezgir. Ammo chirmashib o‘suvchi hujayralarning kelib chiqishidan va viruslarga sezgirligining kamayishidan qat’iy nazar, zararli shish qatoridagi chirmashib o‘suvchi hujayralardan foydalanish zarur.
Chirmashib o‘suvchi hujayralarni har doim qayta ekib turish tufayli saqlab turiladi. Ko‘pchlik holda sentrifugasiz usuldan foydalaniladi.
Navbatdagi ko‘chirib ekish 2-3 kunlik kul’turani yaxshi qavatidan olish uchun oziq muhit to‘kib tashlangach, hujayra qavatini 35-37⁰C qizdirilgan 0,02% - versen eritmasi bilan yopiladi.
Versenni dispergiyalash ta’siri Mg^{+ +}, Ca^{+ +} ikki valentli kationlari hujayrani shishaga yopishishini yaxshilab, hujayraning butunligini ta’minlaydi.
Versen ta’sirida hujayralar yumaloqlanib, shisha devoridan ajrala boshlaydi. Hujayra yumaloqlangandan so‘ng 10-15 daqiqa o‘tgach versen quyib olinib, 1 litrli matrasda 10-15 ml 0,1 litrlida 2-3 ml qoldiriladi va 5-10 daqiqa vaqti-vaqti bilan chayqatilib tutib turiladi, so‘ngra bir oz miqdordagi oziq muhitdan solinadi.
Hujayra oziq muhitida aralashtirilgach, Goryaev to‘rida sanaladi. 1 ml 80-200 ming miqdordagi hujayra oziq muhit bilan aralashtirilib, probirka va matraslarga quyilib rezina tiqin bilan yopiladi, so‘ngra 37⁰C 3-4 kun termostatda to‘lasincha bir qavat hujayra hosil bo‘lguncha o‘stirish uchun qo‘yiladi.
Ko‘pchilik holda Goryaev to‘rida hujayrani sanamasdan 1:2, 1:6 koeffitsientda ekiladi bu holda hujayraning turi inobatga olinadi.
Oziq muhitning tarkibi hujayraning turiga bog‘liq bo‘lib, ko‘pincha chirmashib o‘suvchi hujayrani o‘stirish uchun Igla muhiti, 199 yoki gidrolizat laktalbuminidan foydalaniladi.
Chirmashib o‘suvchi hujayralarni tartibli ravishda qaytadan ekish uchun laboratoriyada bir matrasni doimo saqlab turilib, avvalgi ekish yaroqsiz bo‘lgan holda hujayrani ushbu matrasdan olib ekiladi.
3.Diploidli hujayra kulturasi - Hujayra kulturasi bo‘yicha xalqaro komitet diploidli hujayralarni quyidagicha ta’riflaydi – hujayra populyatsiyasi morfologik bir xil bo‘lgan in vitro - o‘stirish jarayonida moslashgan, cheklangan hayotiychanlikka ega, uch fazada o‘sishi, passaj natijasida kariotipni saqlab qoluvchi, olingan to‘qimaga o‘xshash kontaminantlardan ozod va xomyakchalarda transplantatsiyalashda tumorogen aktivlikka ega bo‘lmagan hujayralardir.
Diploidli hujayra kul’turasini ham chirmashib o‘suvchi hujayralardek, birlamchi o’stirilgan hujayradan olinadi. Hujayra kariotipi juda labil bo‘lib, oddiy usullarda o‘stirilganda birinchi kundanoq o‘zgaradi. Shuning uchun to‘qimaga ishlov berishda maxsus usullardan foydalanish talab qilinadi.
Diploid holatida in vitro hujayrani uzoq vaqt saqlab turish uchun yuqori sifatga ega bo‘lgan oziq muhitlardan foydalaniladi.
Bu vazifani amerikalik olimlar Xeyflik va Murxed (1961) birinchi bo‘lib muvaffaqiyatli echdilar. Diploidli hujayralar (o‘pka, buyrak, teri-muskul to‘qimasi, yurak va boshqalar) odam homilasining har xil to‘qimalaridan olingan bo‘lib, yirik shoxli hayvon homilasining buyragidan, cho‘chqa, BHK-21 xomyakchalarning buyragi va boshqalardan tayyorlanadi.
Diploid hujayralarni chirmashib o‘suvchi hujayralardan farqi shuki ularda passaj qilish cheklangan.
Maksimal passaj qilish soni 50±10 bo‘lib so‘ngra bo‘linadigan hujayralar soni birdan kamayib, so‘ngra o‘ladi.
Ammo diploidli hujayralar uzoq muddat ishlatilishi mumkin, chunki har bir passajda hujayralarni qisman minus 196⁰C muzlatilib, kerak bo‘lgan taqdirda yana qaytadan tiklash mumkin. Diploidli hujayralarni chirmashib o‘suvchi va birlamchi hujayralarga nisbatan ustunligi bor:
Oziq muhitni almashtirganda ham ular 10-12 kun yashovchanlik holatini saqlab qoladi;
Haftada bir marta oziq mihit yangilanadi, 4 haftagacha yashovchanlik holatini saqlab turadi; shu to‘qimaga nisbatan sezgirligi saqlanib qolgan viruslasrni uzoq vaqtgacha o‘stirish uchun yaroqli hisoblanadi.
Suspenziyali hujayra kulturasi.
1953 yilda Ouens xodimlari bilan hujayraning suspenziyali holatda erkin ko‘payish xususiyatlarini ko‘rsatdi.
So‘ngi yillarda bu usul bir necha bor takomillashtirildi: mukammal belgilangan (harorat, pH, almashtirish tezligi) parametrli zamonaviy apparatlar ixtiro qilindi ko‘p liniyadagi chirmashib o‘suvchi hujayralar shu sharoitda BHK-21, Hep-2, MDBK ko‘payishga moslashtiriladi.
Suspenziyali kulturalarda viruslarning o‘stirilishi ishlab chiqarish sanoatida vaksina va diagnostikumlarni tayyorlash mumkinligini isbotladi.
Lekin faqatgina chirmashib o‘suvchi hujayralar suspenziyada yaxshi o‘sadi. Suspenziyada hujayralarni o‘stirish yangi yo‘nalish bo‘lib (sefadeks, silikagel, sitolar va boshqa) mikro tashigichlar ishlatila boshlandi. Mikrotashigichlarda o‘stirilayotgan hujayralar (monosloy) bir qavat hosil qiladi.
Shunday qilib suspenziyali o‘stirish usulida qattiq substratda yopishgan holda: birlamchi, subkultura, diploidli hujayralar parvarish qilinadi.
Bunday hujayralarni yuzaki-qaram bo‘lganlar deb atash qabul qilingan.
Mikrotashigichlarda o‘stirish uslubi hozirgi paytda juda ham mashxur bo‘lib hujayra, biotexnologiyasida, vaksina yoki boshqa biologik aktiv moddalar (interferon, gormonlar va boshq.) olishda katta yo‘nalishni tashkil etadi.
Hujayra kulturasini saqlash
Virusologiya tekshiruvlarida qo‘llaniladigan asosiy uchta turdagi hujayra kulturasini – birlamchi kultura, diploidli shtammlar va chirmashib o‘suvchi qatorlari ko‘p holda konsepvatsiyalashga to‘g‘ri keladi, chunki uzoq muddat in vitro passaj qilinishi tufayli bakteriyalar bilan ifloslanishiga va hujayrani nazorat qilib bo‘lmaydigan o‘zgarishlarga olib kelishi mumkin.
O‘stirilgan hujayralarni koservatsiyalashning eng oddiy usuli 4⁰C 1-6 haftacha saqlab turish hisoblanadi. Hujayra shtammlarini saqlashda (minus 78⁰C) quruq muz yoki (minus 196⁰C) suyultirilgan azot muvaffaqiyatli qo‘llanilmoqda.
Buning uchun hujayralar matrasdan ajratilib 10⁶ konsentratsiyagacha 1 ml oziq muhitda aralashtiriladi. Himoya vazifasini o‘tovchi 10-40% zardob va 10% tozalangan steril glitserin (glitserin o‘rniga DMCO- dimetilsul’foksid) ishlatilishi mumkin.
So‘ngra hujayra suspenziyasi ampulalarga quyilgach, kavsharlanadi, 4⁰C 1-3 soat tutib turilgach hujayralar etil spirti aralashtirilgan quruq muz bilan muzlatiladi. Sovitish tezligi 1 daqiqaga 1⁰C dan oshmasligi kerak.
Haroratni minus 25⁰C pasaytirgach ampulalarni saqlash uchun quruq muzga joylashtiriladi.
Agar saqlash uchun quruq azot ishlatilsa u holda hujayra solingan ampula minus 70⁰C sovutilib so‘ngra suyuq azotga qo‘yiladi.
Suyuq azotda hujayralarni bir necha yil saqlanishi ularning proliferativ aktivligini, viruslarga sezgirligini o‘zgartirmaydi. Muzlatilgan hujayralar solingan ampula tezlik bilan suv hammomiga 1-2 daqiqaga solinib, engilgina silkitilib turiladi, so‘ngra hujayralarni matrasga quygach, ma’lum miqdordagi o‘stiruvchi muhit qo‘shlib termostatda 37⁰C da o‘stirish uchun qoldiriladi.
Glitserinni yoki DMCO ajratish uchun hujayra ekilganining ertangi kuni oziq muhit almashtiriladi.
Hujayralarni transport orqali yuborishda matrasda o‘sgan bir qavat hujayra ustiga qo‘shimcha oziq muhitdan quyilib, so‘ngra rezina tiqin bilan yopiladi.
Laboratoriyada oziq muhit quyib olinib, shu hujayralarni o‘stirishda qo‘shimcha oziq muhit sifatida ishlatiladi. Hujayra suspenziyasini 4⁰C tashuvchi orqali yuborish mumkin.
Qizdirish va muzlatish bo‘lmaganda transport orqali yuborish vaqtida 80-90% hujayralar yashovchanligini 7-8 kungacha saqlab qoladi.
O‘stirilgan hujayralar bilan ishlashda foydalaniladigan idishlar mukammal tozalanadi, eritmalarni, bunda oziq muhitni va yuqori sifatli suvning toza bo‘lishi talab qilinadi.
Metall instrumentlar sovun qo‘shilgan issiq suvda yuvilib so‘ngra suv bilan, undan keyin esa distillangan suv bilan yuviladi, distillangan suvda 30 daqiqa mobaynida qaynatib sterillanadi.
Steril boksda ishlash vaqtida instrumentlar 96^0-etil spirtisolingan stakanda saqlanadi, ishlatishdan oldin instrumentlar spirtlampa alangasida qizdiriladi. Hozirgi paytda biron-bir virusologiya laboratoriyasi o‘stirilgan hujayrasiz ishlay olmaydi. Laboratoriya hayvonlari, tovuq homilasiga nisbatan o‘stirilgan hujayralar quyidagi afzalliklarga ega:
-o‘stirilgan hujayralarni barchasiga virisni yuqtirish tufayli oqsil ballastlarsiz yuqori konsentratsiyadagi virus saqlovchi materialni olish mumkin;
-yuqimli jarayonni doimo nazorat qilib kuzatish mumkin;
-o‘stiruvchi suyuqlik holatida virusni tayyor suspenziyasini olish mumkin;
-zamburug‘ va bakteriyalarga nisbatan o‘stiruvchi suyuqlikni to‘lasincha sterilligi saqlanadi;
-yuqtirish usuli oddiy bo‘lib, virus saqlovchi materialni olish oson;
-nisbatan arzon;
-o‘stirilgan hujayra –viruslarni o‘stirish uchun qulay bo‘lgan laboratoriya sistemasi hisoblanadi. Virusologiya amaliyotida o‘stirilgan hujayralarni, viruslarni birinchi bor uchratishda, patologik materialdan ajtatib olishda, viruslarni bir joyga to‘plab vaksina va diagnostikumlar tayyorlashda, virus shtammlarini laboratoriyada saqlab turishda, viruslarni titrlashda neytrallash reaksiyasini qo‘yishda, test-ob’ekt sifatida ishlatiladi.
Virusni muvaffaqiyatli ajratib olish uchun quyidagi qoidaga rioya qilish zarur:
1)Ishlatilayotgan hujayra, o‘rganilayotgan virusga sezgir bo‘lishi kerak. Hujayralar yosh hayvonlardan (homilidan) olingan bo‘lsa virusga sezgirligi katta bo‘ladi;
2)Yuborilayotgan virus eski bo‘lmasdan, uzoq saqlanmagan bo‘lishi kerak. Aktivligi yoqotilgan virus populyatsiyasi virusning virulent bo‘lakchalarining ko‘payishini to‘xtatadi.
Viruslarni viruletnligi ma’lum bir suyultirish tufayli navbatma-navbat o‘tkaziladigan seriyali passaj tufayli oshadi;
3)Virusni hujayraga yuqtirishda aniq nisbatda tenglashtirib o‘stirilib boriladi. 10mln hujayraga 10⁶-10⁴ TST₅₀ o‘rtacha kattalikda tavsiya etiladi;
4)Virus hujayraga o‘rnashib adsorbsiyalanib olgandan song quvvatlab turuvchi muhitdan qo‘shiladi.
Ko‘pincha 22-37⁰C 1-2 soatdan so‘ng amalga oshishi virusga ko‘pdan-ko‘p bog‘liq. Bir qavat hujayralarda virusni bir tekisda yuqtirish lozim;
5)Viruslarning ko‘payishi uchun optimal harorat 36-38⁰C. Iliq muhitda erkin holda virusning bo‘lishi uning aktivligini yoqolishiga olib keladi. Virusning 75% sitopatogen ta’sir ko‘rsatganini olish maqsadga muvofiq.


Viruslarni o‘stirilgan hujayralarda o‘stirish
O‘stirish uslubi quyidagilardan iborat:
1)o‘stirilgan hujayrani tanlash;
2)virus saqlovchi materialni olish;
3)yuqtirish uchun tayyorlash;
4)virus saqlovchi materialni hajayraga yuqtirish;
5)hujayrada viruslarni o‘stirish;
6)o‘stirilgan hujayrada virusni indikatsiyalash;
7)o‘stiruvchi suyuqlikni to‘plab u erdagi virusni identifikatsiyalash
O‘stirilgan hujayrani tanlash - Har xil hujayralar istalgan virusga sezgir emas. Viruslarni birlamchi o‘stirilgan hujayralarga moshlashuvi, ushbu virusga sezgir bo‘lgan hayvon organidan tayyorlangan bo‘lsa muvaffaqiyatli bo‘ladi. Ammo chirmashib o‘suvchi hujayralarga viruslarning moslashuvi murakkab bo‘lib, ko‘pchilik holda amalga oshmaydi. Ayrim viruslarni o‘stirish uchun hozirgi kungacha o‘stirilgan hujayralardan foydalanish mumkin bo‘lmasdan kelmoqda.
Viruslarni o‘stirish uchun yosh hujayralar ishlatiladi, birinchi kundanoq ayrim hollarda (cho‘chqalarning parvoviruslarida) hujayrani ekish jarayonida virus yuqtiriladi, chunki bo‘linib ko‘payayotgan hujayrada viruslar ham samarali ko‘paya boshlaydi.
Hujayraga yuqtirish –Buning uchun bir qavat hujayra hosil qilingan probirka, matras mikroskopning kichik kattalashtirgichida qarab ko‘rilgach, tanlab olinadi. O‘stiruvchi oziq muhit quyib olinadi, so‘ngra hujayrani zardob antitelolari va ingibitorlaridan ajratish uchun 1-2 marta Xenks eritmasi bilan yuviladi.
Har bir probirkaga 0,1-0,2 ml virus saqlovchi material quyilib, hujayra yuzasiga bir tekisda tarqatib chiqiladi. Shu holatda probirkalar matraslar 1-2 soat davomida 22-37⁰C hujayra yuzasiga virus adsorbsiyalanishi uchun qoldiriladi.
So‘ngra virus saqlovchi materialni probirka, matrasdan quyib olinib quvvatlab turuvchi muhitdan probirkalarga 1-2 ml matras hajmining 10% miqdorida quyiladi. Patologik materialdan virusni ajratib olishda ayrim namunalar (fekaliy va boshqa.) hujayraga zaharli ta’sir ko‘rsatishi mimkin, shuning uchun virus bir qavatga so‘rilgandan so‘ng Xenks eritmasi yordamida 1-2 marta yuvib tashlanib, so‘ngra quvvatlab turuvchi muhit quyiladi.
Virislarni o‘stirish –Probirkalar, matraslar rezina tiqin bilan mustahkam yopilgach inkubatsiya uchun 37⁰C termostatga qo‘yiladi.
Hozirgi paytda statsionarda viruslarni inkubatsiyalash keng qo‘llanilmoqda. Bunday sharoitda matraslar gorizontal holatda joylashtiriladi, probirkalar 5⁰ burchak ostida yotqizilib hujayra monosloyi oziq muhit tagida turishi kerak.
Bir qator laboratoriyalarda viruz yuqtirilgan hujayralar aylanadigan Roller sistemasida inkubatsiyalanadi. Bunday statsionar usuldan foydalanish tufayli virusni yuqori titrda o‘stirib ko‘p miqdorda olish mumkin. Materialning har bir namunasiga 4-10 probirkadagi o‘stirilgan hujayra kerak bo‘ladi.
Nazorat qilish uchun 4-6 probirkada yuqtirilmagan hujayra qoldirilib ularning o‘stiruvchi muhitini quvvatlab turuvchi muhitga almashtiriladi.
Virus yuqtirilgan hujayralarning oziq muhitini 7-kun davomida almashtirilmasa ham bo‘ladi, oziq muhitni pH (6,9-7,4) 7,5% natriy bikorbonatning eritmasi yordamida tutib turish mumkin.
Adenoviruslar yuqtirilgan hujayralar uzoq muddat o‘sishi sababli oziq muhit almashtiriladi.
Barcha probirka, matraslardagi hujayralarga virus yuqtirilgandan so‘ng har kuni mikroskopning kichik kattalashtirgichida hujayrani taqqoslab ko‘rib turish uchun virus yuqtirilgan nazoratdagi hujayralar tekshirib boriladi.
Termostatda, hujayraga adsorbsiyalangan virus bo‘lakchalarining hujayra ichkarisiga kirishi natijasida ularning reproduksiyalanishi boshlanadi.
Hujayra ichida hosil bo‘lgan yangi virus bo‘g‘inchalari to‘lasincha yoki qisman hujayradan ajralib chiqadi. So‘ngra jarohatlanmagan yangi hujayralarga kirib u erda reproduksiyalanadi va ularni ham zararlantiradi. Bunday holat zararlanmagan hujayra qolmaguncha davom etaveradi.
Bu jarayonda probirkadagi, matrasdagi hujayralar virus bilan zararlanadi. Ammo absolyut barcha hujayralar virus bilan zaralanadi, deb aytishimiz mumkin emas.
Viruslar o‘stiruvchi suyuqlik tarkibida to‘planib, ayrim virionlar virus buzib chiqmagan hujayra ichida qolishi mumkin.
Hujayra tarkibida qolgan virusdan ajratish uchun, hujayrani bir necha bor 2-3 marta muzlatilib so‘ngra eritish tufayli yoki ultratovush yordamida ajratib olinadi.