Учебное пособие по курсу «Медицинская биохимия» /Л. А. Ганеева, Л. И. Зайнуллин

Работа 22. Определение активности рибонуклеазы 
спектрофотометрическим методом 
Под действием рибонуклеазы происходит расщепление молекулы РНК до 
олиго- и мононуклеотидов, количественное определение которых проводят 
спектрофотометрически при 260 нм (максимум поглощения нуклеотидов). 
Реактивы и оборудование: 
Раствор очищенной дрожжевой РНК (1 мг / мл) в 0,1 М растворе ацетата 
натрия: 5 г РНК растворяют в 50 мл 0,1 M ацетатного буфера (pH 5,2) и 
диа-лизуют в течение ночи на холоде против этого буфера. Затем РНК 
осаждают двойным объемом 96 % этанола, центрифугированием при 1 800 
оборотах в течение­ 45 минут отделяют осадок. Полученный осадок РНК 
промывают 96 % этанолом и эфиром, затем высушивают в вакуумном 
эксикаторе: 0,2 % водный раствор панкреатической РНК-азы; спиртово-
магниевый осадитель (80 % этанол­, содержащий 0,02 М MgCl
2
в 1 л). 
Реактивы готовить непосредственно перед работой. Холодильник, 
центрифуга, спектрофотометр, термостат, пипетки­ на 1 мл, пробирки. 
Ход работы: 
В центрифужные пробирки вносят
 
0,4 мл дрожжевой РНК
 
и 
0,2 мл водного раствора РНК-азы, перемешивают и ставят в термостат при 
37 °С на 30–60 минут. По истечении времени реакцию останавливают, до-
бавляя к содержимому­ пробирки 1мл спиртово-магниевого осадителя и 
поме-щают на 1 час в ледяную баню. Затем проводят центрифугирование 
(8 000 g, 20 минут при охлаждении­) для удаления осадка РНК. 
Из центрифугата отбирают пробы по 0,5 мл, прибавляют к каждой по 3 мл 
дистиллированной воды, перемешивают и измеряют оптическую плотность 
полученных растворов на спектрофотометре против дистиллированной воды. 
Параллельно обрабатывают контрольную пробу, в которую осадитель вносят 
до прибавления раствора РНК-азы. 
Прирост поглощения в опытной пробе по отношению к контрольной слу-жит 
показателем активности РНК-азы и используется для расчета активности 
фермента­ по формуле: