Toshkent tibbiyot akademiyasi mikrobiologiya, virusologiya va immunologiya kafedrasi sh. R. Aliev, Z. A. Nuruzova, N. T. Yodgorova mikrobiologiya, virusologiya va immuno

5. O’quv mashg’uloti natijalari

Talaba bilishi kerak:

• 
  yuqumli kasalliklarga seroloik tashhis qo’yishda immunobloting va polimeraz zanjirli reaksiya usullarini ahamiyati haqida ma’lumotga ega bo’lishi;
  
• 
  immunobloting va polimerazzanjirli reaksiya usullarini mohiyatini, mexanizimlarini bilishi;
  
• 
  Talaba qila olishi kerak:
  

• 
  immunobloting reaksiyasi qo’yish tartiblarini bilish;
  
• 
  polimeraz zanjirli reaksiyani qo’yish tartiblarini bilish;
  

PZRusulining qo’yish texnologiyasi.

1. 
   Qon plazmasi, zardobi, orqa miya suyuqligi (OMS) yaxlit periferik qon ertalab nahorgi tarkibida 1:20 hisobidan 6% li EDTA eritmasi bo’lgan probirkaga olinadi. Tarkibida yaxlit periferik qon tutuvchi berkitilgan probirka bir necha marta ag’dariladi. Plazmani olish uchun qon tutuvchi probirka 20 daqiqa davomida 1600g dastentrifuga qilinadi. Qon zardo-
   bi standart usuli bilan olinadi. OMS avvaldan qayta ishlash bosqichini o’tmaydi.
   
2. 
   Hayvonlarning ichki a’zolari va sekstion material – ushbu material chinni hovoncha va dastadan foydalangan holda gomogenlanadi, so’ngra steril fiziologik eritmada yoki fosfatli buferda 10 % li suspenziya tayyorlanadi.
   
3. 
   Chivinlardan suspenziya tayyorlash uchun dastlab ularning turi aniqlanadi, «to’plamlar» shakllantiriladi (50 ta zotdan ortiq, emas), gomogenlanadi, fiziologik eritma yoki 1 chivin - 30 mkl hisobidan fosfatli
   buferda gomogenlanadi. Sinamalar 10000 aylanish daqiqada stentrifuga qilinadi, 100 mkl cho’kma usti suyuqligi tanlab olinadi.
   
4. 
   Kanalardan suspenziyalar tayyorlash uchun dastlab ularning turi, to’ydirilganlik darajasi aniqlanadi va bunga bog’liq, ravishda kanalarning «to’plamlari» shakllantiriladi va suspenziya tayyorlanadi.
   

DNK/RNK ekstrakstiyasi quyidagilarni o’zichiga oladi:

• 
  Biologik material;
  
• 
  Hujayrali virusli qobiqlarning lizisi;
  
• 
  Nukleoproteid komplekslarning destrukstiyasi;
  
• 
  ekzo va endogennukleazalarning inaktivastiyasi va chiqarib tashlanishi;
  
• 
  PZR ingibitorlarining inaktivastiyasi va chiqarib tashlanishi;
  

Ekstrakstiyaning so’nggi mahsuloti - yuqori samarali DNK yoki RNK preparat.

Polimerazli zanjir reaksiyasi – invitro tarzida DNK – polimeraza fermenti tomonidan katalizlanuvchi DNK – nishonlar fragmenti nusxalarining ko’p martalik ortishi. Mazkur usul asosida DNK molekula-

larining DNK – polimeraza fermenti bilan tabiiy replikastiyasi yotadi.

DNK tabiiy replikastiyasi bir nechta bosqichdan iborat:

1. 
   DNK denaturastiyasi (ikkilangan spiralning yechilishi, DNK iplarining tarqalishi);
   
2. 
   DNK qisqa ikki zanjirli qismlarining paydo bo’lishi (DNK sintezining inistiastiyasi uchun zarur bo’lgan moddalar);
   
3. 
   DNK yangi zanjirining sintezi (ikkala ipning komplementar tarzda qurib bitkazilishi).
   

Zanjirning komplementar tarzda qurib bitkazilishi faqatgina ma’lum startlibloklari – qisqa ikkita ipli qismlarda boshlanadi. Bunday bloklarning DNK spestifik uchastkalariga qo’shilishida yangi zanjirning sintez jarayonini DNK zanjir bo’ylab emas, balki faqatgina ushbu qismga yo’naltirish mumkin bo’ladi. Boshlang’ich bloklarni DNK berilgan qismlarida yaratish uchun “praymerlar” deb nomlanuvchi ikkita oligonukleotid qo’llaniladi. Praymerlar spestifikfragmentning chap va o’ng chegaralarida DNK ketma – ketligiga komplementar bo’lib, DNK yangi zanjirining qurib bitkazilishi faqatgina ularning orasida kechishiga
yo’naltirilgan bo’ladi. DNK izlanayotgan fragmentini yetarli miqdorda olish uchun amplifikastiya bir nechta (20 - 40) stikllarni o’z ichiga oladi.

Amplifikastiyani o’tkazish uchun quyidagi komplementlar zarur bo’ladi:

1. 
   Tarkibida izlanayotgan spestifik fragmentni tutuvchi DNK boshlang’ich molekulasi (matrista).
   
2. 
   Aniqlanayotgan spestifik fragmentning chegaralarida DNK ketma-ketligiga komplementar bo’lgan praymerlar (20 - 30 nukleotid juftliklarning sintetik oligonukleotidlari).
   
3. 
   Dezoksinukleotid trifosfatlar (DNTF – DNK yangi komplementar zanjirining sintezi uchun material bo’luvchi to’rtta DNTF aralashmasi).
   
4. 
   Taq-polimeraza fermenti (sintezlanuvchi DNK o’sib boruvchi zanjiriga ketma-ket birikishi yo’li bilan praymerlar zanjirlarining uzayishini katalizlovchi termobarqaror DNK-polimeraza);
   

Buferli eritma (fermentning faolligini ushlab turish uchun zarur bo’lgan Mg²⁺ ionlarini tutuvchi reakstion muhit).

Amplifikastiyaning Har bir sikli o’z ichiga turli harorat tartibida kechadigan 3 ta bosqichnioladi:

1. 
   bosqich - DNK denaturastiyasi (ikkilangan spiralning bo’shatilishi). 93°- 95°Cda 30 - 40 soniya davomida kechadi.
   
2. 
   bosqich - praymerlarning birikishi (yumshatish).Spestifik qismning chegaralarida DNK zanjirlarining qarama – qarshi zanjirlarida mos keluvchi ketma- ketlikka komplementar tarzda kechadi. Praymerlarning Har bir juftligi uchun yumshatishning o’z harorati mavjud bo’lib, uning ahamiyati 50-65°C oralig’ida joylashadi. Yumshatish vaqti 20-60 soniya.
   
3. 
   bosqich - DNK zanjirlarining qurib bitkazilishi. DNK zanjirlarining komplementar tarzda qurib bitkazilishi praymerlarning qo’shilish uchastkalaridan boshlanib, zanjirning 5-oxiridan 3-oxirigacha ro’y beradi. DNK yangi zanjirlari sintezi uchun material sifatida eritmaga qo’shiladigan dezoksiribonukleotidtrifosfatlar (DNTF) xizmat qiladi. Sintez jarayoni DNK – polimerazaning termostabil fermenti tomoni-
   dan katalizlanadi(Taq-polimeraza) va 70-72°C haroratda kechadi. Sintezning kechish vaqti - 20-40 soniya.
   

Amplifikastiyaning Birinchi siklida hosil bo’lgan DNK yangi zanjirlari amplifikastiyaning ikkinchi sikli uchun matrista bo’lib xizmat qilib, unda DNK izlanayotgan spetsifik fragmentining (amplikonning) paydo bo’lishi ro’y beradi. Amplikastiyaning keyingi sikllarida amplikonlar yangi zanjirlarning sintezi uchun matrista bo’lib xizmat qiladi. Shunday qilib, eritmada 2 pformulasi bo’yicha amplikonlarning to’planishi ro’y berib, bu yerda amplifikastiya sikllarining soni. Shuning uchun agar boshlang’ich eritmada DNK molekulasining faqat
bittagina ikki zanjirli molekulasi bo’lgan bo’lsa, 30 -40 sikllar orasida amplikonlarning 108 ga yaqin molekulasi to’planadi. Bu miqdor ishonchli tarzdagi detekstiya uchun yetarli hisoblanadi.

58-rasm. PZR ning qo’yish sxemasi. dDNK –dezoksinukleotidtrifosfat

PZR – PZR tarkibida RNK tutuvchi biologik materialning tekshirilishi quyidagi bosqichlardan iborat:

- tekshirilayotgan namunalardan RNK ekstrakstiyasini o’tkazish;

• 
  «real vaqt» tartibidagi bridizastion flyuoresstentli detekstiya bilan teskari transkripstiya va amplifikastiyani o’tkazish;
  
• 
  Natijalarni tahlil qilish va izohlash.
  

PZR o’tkazish uchun tahlilning turli bosqichlarini hududiy jihatdan ajratish zarur bo’lib, ular alohida xonalarga joylashtiriladi. Laboratoriyadagi faoliyat bir tomonlama (ketma - ketlik), PZR oldingi xonalardan PZR - xonalariga qarab tashkil etilishi kerak.

• 
  Biologik materialni qabul qilish, ro’yxatga olish va birlamchi qayta ishlov berish xonasi.
  
• 
  DNK/RNK ajratib olish, PZR uchun reakstion aralashmani tayyorlash, PZR uchun reakstion aralashma va namunalarni probirkalarga aralashtirish (ushbu ishlarni turli laminar bokslarda o’tkazish kerak) uchun PZR – oldingi xona.
  
• 
  Mahsulotlarni detekstiyalash o’tkaziladigan PZR -xona. Ushbu xonada infekstiyani detekstiya qilishning boshqa usullariga ham yo’l qo’yiladi.
  

PZR klassik usuli (gel-elektroforez) qo’llanilganda qo’shimcha xonalar talab qilinadi.

Biologik materiallarni qayta ishlash xonasi va reakstion aralashmani tayyorlash xonasida ultrabinafsha lampali yoki laminarli stolustibokslari o’rnatilgan bo’lishi lozim.

PZR - tashxis qo’yish laboratoriyasi faqatgina ushbu xonada qo’llaniladigan o’zining reagent to’plamlari, avtomatik pipetkalar (dozatorlar), uchliklar, plastik va shishali idishlar, laboratoriya jihozlari, xalatlar va qo’lqoplarga ega bo’lishi kerak.

Har bir xonadagi jihozlar, materiallar va ashyolar mos keluvchi belgiga ega bo’lib, ularni boshqa xonalarga olib chiqilishi taqiqlanadi.

Ish olib borishga oliy va o’rta maxsus ma’lumotga ega bo’lgan, tashxis qo’yishning molekulyar – genetik usullar (PZR) bo’yicha maxsus kurslarda o’qigan, hamda biologik xavfsizlik bo’yicha tayyorgarlik o’tgan shaxslar qo’yiladi.