Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева

2. Хақиқий вақт режимида полимераза занжирли реакциясини ўтказиш (Real-Time PCR)
Усулнинг асосланиши. Усул маълум бир тўлқин узунлигида ёруғлик энергиясини ютиши натижасида флуоресценция хусусиятига эга ва уни бошқа тўлқин узунлигида нурлантиришга қодир бўлган молекулалар - флуорофорларни қўллашга асосланган. Реакцион аралашмага ДНК-зондлар қўшилади, уларни таркибига 5`-ҳолатда флуоресцент ва 3`-ҳолатга флуоресценцияни сўндирувчи белги, хамда 3`-ҳолатда фосфат кислота киради. Бу зондлар амплификацияланувчи соха ичида ўрнашган бўлади. Сўндирувчи флуоресцент белгидан тарқалаётган нурланишни ютади, 3`-ҳолатдаги фосфат гурухи эса ДНК-полимеразани блоклайди. ПЗР жараёнида праймерларни юмшатиш босқичида ДНКнинг комплементар занжирига ДНК-зондларни бирикиши юз беради, бунда ПЗР боришида амплификация маҳсулотлари қанчалик кўп миқдорда бўлса, шунчалик мос келувчи ампликонлар билан зонд молекуласи кўп бирикади. Элонгация босқичида полимераза ДНКнинг комплементар занжирини синтезлайди ва зонд даражасига етиб борганда 5`-экзонуклеаз фаолликка эгалиги сабабли уни парчалашни бошлайди. Шундай қилиб, флуоресцент белги ва сўндирувчини ажралиши юз беради, бу эса детектирланган нурланишни ортишига олиб келади. Хақиқий вақт мобайнида ПЗР боришида қанчалик кўп ампликонлар синтезланса, нурланиш шунчалик интенсив бўлади.
Иш тартиби. ДНК амплификацияси усули Taqman зондларини қўллаш билан амалга оширилади.
1. ПЗР ўтказиш учун барча зарур реагентлар тайёрланади.
2. Стерил пробиркада компонентлар қўйидаги нисбатда аралаштирилади (1-жадвалга қаранг).
1 жадвал
ПЗР ўтказиш учун компонентларни аралаштириш схемаси

Компонент	Охирги концентрация	50 мкл аралашма-даги компонент миқдори
10х ПЦР-буфер	1х	5 мкл
10мМ смесь дНТФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфат)	0,2 мМ хар бирига	1 мкл
Праймер 1 (5 мкМ)	0,1 мкМ	1мкл
Праймер 2 (5 мкМ)	0,1 мкМ	1мкл
TaqMan	0,25 мкМ	1 мкл
Taq-ДНК-полимераза	1,25 ед.	0,5 мкл
25мМ MgCI2	3,5 мМ	7 мкл
ДНК-матрица	0,1–1 мкг	наъмуна концентрациясига боғлиқ
Деионлашган сув	–	50 мкл гача

3. Вортексда аралаштирилади. Наъмуналар ДНК-амплификаторга жойлаштирилади ва дастур ишга туширилади:

• 
  ДНКни бирламчи денатурацияси 95^оС да 10 дақиқа.
  
• 
  Цикл денатурацияси 95^оС да 15 с.
  
• 
  Занжир элангацияси билан праймерларни юмшатиш 60^оС да 1 дақ.
  
• 
  Флюоресцент сигнал детекцияси.
  
• 
  Амплификация циклини 40-45 марта қайтариш (2-4 босқичлар).
  
• 
  ПЗР реакция типини ўтказиш учун специфик полимеразалар ишлатилади (Pfu, Pwo ва бошқ.), уларнинг фаоллиги 60–72^оС харорат чегарасида намоён бўлади.
  
• 
  Реакциядан сўнг эриш эгри чизиғини тузиш шарт эмас (бу ПЗР-маҳсулотлар эриши эгри чизиғи эмас, балки ампликон билан зонд дуплексидир).