Рестриктазалар – ДНКни қатъий бир жойдан (сайтдан) ажратувчи ферментлардир. Рестриктазларни турли бактериялар ҳужайраларидан ажратиб олинади. Хар бир рестриктаза фақат ўз рестрикция сайтини танийди. Хозирги кунда 500 дан ортиқ рестриктазалар маълум. Масалан, EcoRI рестриктазаси GAATTC палиндром нуклеотид кетма-кетлигини танийди ва парчалайди.
Молекуляр клонлаштириш учун векторбўлиб ҳўжайин-ҳужайрага бегона ДНКни киритишга қодир ДНК молекуласи ҳисобланади. Вектор унчалик катта бўлмаган бўлмаслиги, қўшимча киритилиш мумкин бўлган рестрикция сайтига эга бўлиши, ягона бегона ДНК тутувчи реципиент ҳужайрани танлаб олиш учун селектив ирсий маркерга эга бўлиши зарур (1-расм). Клонлаштириш учун вектор бўлиб қуйидагилар саналади:
Плазмидлар – ўзи репликацияланувчи экстрахромасом қўш занжирли ҳалқасимон бактерия ДНК молекуласи. Плазмидаларда 10 минггача нуклеотид жуфтлигига эга ДНК фрагментини клонлайди.
1-расм. Молекуляр клонлаштириш чизмаси. Фаглар. Илк марта λ E. coli. фаги асосида вектор топилган. ДНК λ фаги тахминан 50 минг нуклеотид жуфтидан (м.н.ж.) иборат. Унинг бир қисми (20 м.н.ж.) фагнинг кўпайишида аҳамиятли эмас ва бегона ДНК билан алмаштирилиши мумкин. Фагда ДНКнинг 20 м.н.ж. гача фрагментларни клонлаштириш мумкин.
Космидлар – ўзида плазмида ва фаг хусусиятларини мужассам этган векторлардир. Сунъий тарзда ташкил қилинган. Бактерияларга плазмида сифатида амплификацияланиши мумкин ва фаг бошчасига жойлашиши мумкин. 40 м.н.ж. гача бўлган миқдорда бегона ДНКга қўшимча киритиши мумкин.
Сунъий ачитқи хромасомаси (yeast artificial chromosome –YAC). Ачитқи ДНКси асосида яратилган вектор. Эукариотларда ДНКнинг катта фрагментларини (100 дан 1000 м.н.ж.) клонлаштириш учун қўлланилади. Рекомбинант ДНК технологияларини қўллаш орқали инсулин, соматотроп гормон ва бошқа инсон гормонларини олиш мумкин.
2-расм.ПЗР чизмаси
Полимераза занжирли реакция (ПЗР). Лаборатор диагностикада полимераза занжирли реакцияни (ПЗР) қўллаш ирсий материални аниқлашга асосланган ва умумий “генодиагностика” атамаси билан номланувчи янги йўналишдаги диагностик усулларни ривожланиши учун асос бўлди. ПЗР тахлилнинг юқори даражадаги спецификлигининг ўзига хослиги шундаки, уни геномнинг ноёб фрагментида ўтказилишидир.
ПЗР нинг умумий принципи уни ДНК-полимераза ферменти билан ДНКнинг специфик фрагментида мақсадли тарзда нусхалар (амплификация) сонини кўп марта орттиришдир. Янги комплиментар занжирлар синтези учун ДНК-полимераза хар икки томондан амплификацияланувчи фрагментлар билан чегараланувчи, бир занжирли олигонуклеотидларни (праймерлар) асос сифатида олади (2-расм).
Реакция кўп марталаб такрорланувчи харорат цикли (25-50 марта) шароитида амалга оширилади ва қуйидаги босқичлардан иборат бўлади:
1. Денатурация – реакцион аралашмани юқори даражагача қиздириш (одатда 94-95°С), бунда ДНК нинг барча комплекслари диссоциацияланади, жумладан нишон ДНКнинг қўш спирали хам ёйилади;
2. Праймерларни юмшатиш ёки гибридизация – аралашма праймерлар нишон ДНК билан комплекс праймердар ҳосил қилишга қодир бўлган хароратгача совитилади;
3. Элонгация –ДНК занжирини узайтириш, бу ДНКнинг специфик фрагментини икки хисса кўпайиши билан ДНК занжири узаяди.
Термостабил ферментни ПЗР учун қўллаш (одатда Thermus aquaticus бактериясидан олинган Taq-полимераза ёки унинг рекомбинант такомиллашган вариантлари қўлланилади) фермент фаоллигини сақлаган ҳолда амплификация циклини кўп марта қайтаришга имкон беради.
Taq-полимераза билан элонгация тезлиги 72°С хароратда максимал даражада бўлади. Самарали амплификацияга тўсқинлик қилувчи омиллар бўлмаганда бир цикл давомида нишон ДНК специфик сохалари (ампликонлар) нусхаси икки марта, 30 циклдан кейин эса – 109 марта ортади. Шунинг учун амплификация қилмасдан уларни аниқлашнинг имкони бўлмаган патоген микроорганизмларнинг кичик миқдорларини аниқлашда ПЗР усулини лаборатор диагностикада кенг қўлланилади. Назарий жихатдан олиб қараганда ПЗР ёрдамида нишон ДНКнинг ягона молекуласини хам аниқлаш мумкин. Амалиётда ишонарли натижаларга эришиш учун реакцион аралашмали пробиркада специфик ДНКларнинг бир неча ўн нусхаси бўлиши талаб этилади.
1990 йиллар бошларида хақиқий вақт режимида ампликонларни детекция қилиш (Real-Time PCR) усули яратилди, бунинг натижасида синамадаги нишон ДНКни дастлабки миқдорини аниқлаш имкони пайдо бўлди.
Замонавий лаборатор диагностика Real-Time PCR патоген микроорганизмлар ирсий материали специфик фрагментларини аниқловчи усул сифатида амалиётга жадал равишда тадбиқ этилмоқда ва реакция тугаши бўйича амплификация маҳсулотларини детекцияси билан ПЗР вариантларини секин аста сиқиб чиқрамоқда.
Пробиркаларни очмасдан туриб ампликонларни тўпланиш детекциясини амалга ошириш имконияти ушбу усулнинг асосий устунлиги хисобланади, бу эса синамалар ва амплификация маҳсулотлари билан реагентларни контаминацияси сабабли ёлғон ижобий натижалар олиш хавфини камайтиришга олиб келади. Текширилувчи синамаларда манипуляциялар миқдорини сезиларли камайиши натижасида унга сарфланадиган вақт тежалади, тахлил қилиш соддалашади ва юзага келиши мумкин бўлган хатоликлар камаяди. Праймерлар билан гибридизацион зондларни қўлланилиши тахлилнинг спецификлигини оширади (3-расм). Бир неча гибридизацион ДНК-зондлардан тарқалувчи флуоресцент сигналларни бир вақтни ўзида қайд қилиш имкони бир ёки турли нишон ДНКларнинг турли сохаларини бир вақтни ўзида текширишга имкон беради. Лекин лаборатор диагностика усуллари орасида ўз ўрнига эга бўлган Real-Time PCR усулининг асосий хусусияти шундаки, бу клиник синамада нишон ДНК специфик нусхаларининг дастлабки миқдорини аниқлаш имконидир.
