С. А. Эгамбердиева молекуляр

Е. coli 
да грамманфий бактерия 
Providencia stuartii
рестриктазаси гени 
Pstl
ни ажратиш ва клонлаш стратегияси 
кўрсатилган. 
 
Расм. 15.1. 
Pst
I рестриктаза 
генини клонлаш ва уни 
ташувчи 
трансформацияланган 
бактериал ҳужайраларни 
танлаб олиш. 
P.stuartii
хромосома ДНКси 
Hin
dIII 
билан парчаланади ва 
фрагментлар pBR322 
плазмидага киритилади. 
Рекомбинант плазмидалар 
билан 
E. соli
НВ101 
ҳужайралари 
трансформацияланади ва 
улар суюқ муҳитда 
ўстирилади, кейин эса 
бактериофаг λ билан 
инфекция юқтирилади. 
Фагга чидамли 
трансформантлар танлаб 
олинади; айнан улар 
клонланган 
Pst
I генини 
ташийди ва 
экспрессиялайди. (Глик ва 
Пастернак бўйича) 
1. 
P. stuartii 
ДНКси
Hin
dIII ёрдамида парчаланади ва 
фрагментлар pBR322 плазмиданинг 
Hin
dIII
-
сайтига киритилади. 
2. Рекомбинант плазмидалар билан 
E. соli
НВ101 ҳужайралари 
трансформацияланади ва улар суюқ муҳитда ўстирилади, кейин эса 
бактериофаг λ билан инфекция юқтирилади. Агар хўжайин 
ҳужайрада рестрикция ферменти экспрессияланса, у ҳолда ҳужайра 
ДНКси синтезланаётган рестриктаза билан фаол парчаланадиган λ 
типидаги фагларнинг литик таъсирига чидамли бўлиб қолади.

---

97 
3. 
λ фагга чидамли трансформацияланган ҳужайралар 
периплазматик оқсилларни ажратиб чиқариш учун осмотик шокка 
дучор қилинади. 
Pst
I рестриктазанинг фаоллиги оқсилли экстрактда 
аниқланади. 
4. Мусбат клонларни 
Pst
I-метилирловчи фаоллик борлигига 
текширилади. 
Мазкур тажрибада аниқланган битта мусбат клон рестриктаза 
ва Art метилазанинг интакт (бузилмаган) оперони ва 
P.stuartii
промотори бўлган 4 минг.н.ж. узунликка эга киритилган ДНК 
фрагментини сақлайди
. 
Мазкур генетик конструкцияни ташувчи 
клонда синтезнинг табиий вақт тартиби сақланган: дастлаб 
метилирловчи 
фермент, 
кейин 
рестрикция 
эндонуклеазаси 
синтезланган.
Е.coli 
даги рестриктаза 
Pst
I 
гени экспрессия даражаси 
P.stuartii
дагидан тахминан 10 баробар ортиқ бўлган
. 
Тахмин қилинганидек, 
рестриктаза периплазматик бўшлиқда, метилаза эса – цитоплазмада 
жойлашган. 
Е.соli 
да мос генни клонлаб 
Pst
I олиш мазкур ферментни 
P
.s
tuartii 
дан ажратишга нисбатан анчагина самаралироқдир
.
Рестрикция ва модификация (метилирлаш) ферментларини 
кодлайдиган генларни ажратиш учун қуйида келтирилганлардан 
иборат бўлган бошқа ёндашувни қўллаш мумкин: 
1.
Рестрикциянинг 
маълум 
эндонуклеазасини 
ишлаб 
чиқарувчи организм-донор ДНКси клонлари банки яратилади. Бунда 
фойдаланилган плазмида вектори мазкур рестриктазанинг ҳеч 
бўлмаганда битта таниб олиш сайтига эга бўлиши керак. 
2.
Е. coli 
гибрид плазмидалар билан трансформацияланади. 
3.
Суюқ 
селектив 
(танлаш) 
муҳитида 
ўстирилган 
трансформацияланган ҳужайралардан (яъни плазмидага эга бўлган 
ҳужайралардан) плазмид ДНК ажратиб олинади. 
4.
Унга 
тадқиқотчини 
қизиқтирган 
рестрикция 
эндонуклеазаси билан ишлов берилади. 
5.
Е.coli 
рестрикция эндонуклеазаси билан ишлов берилган 
плазмида ДНКси билан трансформацияланади. 
Ушбу усулнинг асосий томони шундан иборатки, клонларнинг 
модификация ферменти генини ташувчи ва экспрессияловчи 
плазмида ДНКси мос келувчи рестрикция эндонуклеазаси томонидан 

---

98 
парчаланишга чидамли экан, чунки ундаги таниб олиш сайти 
метилирланган. 
Қуйидаги мисолни кўриб чиқамиз. pBR322 плазмидага