|
НАЗОРАТ САВОЛЛАРИ
1.
Электрофорез усулининг асосида қандай тамойил ётади?
2.
150 мл 2.5%-ли гел тайёрлаш учун қанча оғирликдаги агароза зарур
бўлади?
3.
ДНКнинг 350 ва 150 н.ж. ўлчамли фрагментларини электрофорез
усули билан ажратиш учун қандай концентрацияли агарозали
гелдан фойдаланиш лозим?
4.
Электрофорез ўтказилганда ДНК молекулалари қайси йўналишда
ва нима учун ҳаракатланади?
5.
Электрофорез жараёнида ДНК молекулалари агарозали гелда
ҳаракатланиш тезлиги қандай омиллар билан боғлиқ бўлади?
6.
Нима учун гелда ҳаво пуфакчалари ҳосил бўлишига йўл қўймаслик
керак? Нима ҳисобига ДНКнинг гелдаги визуализацияси содир
бўлади?
7.
Электрофорез вақтида гелда ДНК молекулалари ҳаракатини қандай
қилиб назорат қилиш мумкин?
8.
Электрофорез ўтказилишининг қайси босқичида қўлқопларда
ишлаш зарур ва нима учун?
94
§ 15. Тижорат маҳсулотларини ишлаб чиқаришда
рекомбинант микроорганизмлардан фойдаланиш
Генларни ажратиш ва клонлаш стратегияси
Ҳозирги вақтгача молекуляр биотехнология соҳасидаги
тадқиқотларнинг асосий мақсади турли хил оқсиллар олиш бўлиб
келган. Бироқ рекомбинант ДНК технологиясидан шунингдек
кўпгина қимматли паст молекулали бирикмалар – витаминлар,
аминокислоталар, антибиотиклар ва бошқаларни кенг кўламда ишлаб
чиқаришда фойдаланиш мумкин. Оқсилни – специфик ген
маҳсулотини – олишнинг самарали экспрессия тизими мавжуд
бўлганда бу алоҳида қийинчилик туғдирмайди. Оқсил бу олиниши
исталган ўша охирги маҳсулот (масалан рестрикцияловчи
эндонуклеаза), ёки муайян кимёвий реакцияни (масалан,
антибиотиклар биосинтези реакциясини) катализацияловчи фермент
бўлиши мумкин. Баъзан генетик манипуляциялар натижасида
микроорганизм янги фермент синтезлаш хусусиятига эга бўлади ва in
vivo шароитида улардан паст молекулали бирикмалар – витаминлар,
аминокислоталар,
бўёқлар,
антибиотиклар,
турли
биополимерларнинг турли хил ўтмишдошлари ва бошқаларни
олишда фойдаланиш мумкин. Бундай микроорганизм фойдали
метаболитларни ишлаб чиқариш бўйича “фабрика” бўлиб қолади.
Агар тадқиқотчиларнинг ихтиёрида керакли рестрикция
эндонуклеазалари (рестриктазалар) бўлмаганда, рекомбинант ДНК
технологияларини ривожлантиришнинг имкони бўлмаган бўлар эди.
Ҳозирги вақтда савдода 300дан ортиқ турли хил рестриктазалар
мавжуд. Мазкур ферментларни энг турли хил: аэроб, анаэроб,
фотосинтезловчи, диазотроф, мезотроф, термофил, психрофил, секин
ва тез ўсувчи микроорганизмлар синтезлайдилар. Уларнинг ҳар
бирини ўстириш учун ферментациянинг турли хил шароитларини:
ҳарорат, pH, муҳит таркиби, кислород концентрациясини танлаб
олиш зарур – керакли фермент ишлаб чиқаришни максимал даражада
ошириш учун. Кўп сонли микроорганизмларни етиштириш, кўп
компонентли муҳитларни тайёрлаш, турли хил ферментларни ишлаб
чиқиш ва кўпчилик организмлар учун оптимал ўсиш шароитларини
танлашга вақт сарфлашга тўғри келмаслиги учун кўпинча
Escherichia
coli
да рестрикция эндонуклеазалари генлари клонланади
.
Бу керакли
95
маҳсулотларни олиш шароитларини стандартлаш имконини беради.
Бундан ташқари,
Е. coli
ҳужайралари культураси тезда юқори
зичликка эришади ва керакли ферментни ортиғи билан ишлаб
чиқариш учун мослашиши мумкин бўлади.
Е. coli
ва баъзи бошқа микроорганизмларда бегона генларни
ажратиш ва экспрессиялаш технологияси яхши ишлаб чиқилган,
лекин шуни унутмаслик лозимки, хўжайин-организмда гетерологик
оқсилни синтезлаш унга негатив таъсир кўрсатиши мумкин. Масалан,
бундай оқсилни ортиғи билан ишлаб чиқариш хўжайин организми
ресурслари битишига олиб келиши ва унинг ўсишига салбий таъсир
кўрсатиши мумкин. Гетерологик оқсил мавжудлиги ҳужайра-
хўжайин учун ҳалокатли бўлиши мумкин. Яъни рестрикция сайтлари
ДНКнинг барча молекулаларида мавжуд, ва агар клонланган геннинг
маҳсулоти рестрикция эндонуклеазаси бўлса, у ҳолда махсус ҳимоя
механизмлари бўлмаганда у хўжайин ДНКсини парчалайди.
Рестрикция
эндонуклеазасини
синтезлайдиган
микроорганизмлар томонидан ўз-ўзини ҳимоялаш тизими ишлаб
чиқилган: рестриктаза сайтининг бир ёки бир нечта асосларини
метилирлайди, ва мазкур сайтда ДНКнинг гомологик рестрикция
эндонуклеазаси билан парчаланиши блокланади. Грамманфий
микроорганизмлар яна бир ҳимоя механизмига эга: уларда
рестрикция эндонуклеазалари периплазматик бўшлиқда жойлашган.
Бундай компартментализация туфайли рестриктазалар ва ДНКнинг
бири биридан ажралиши содир бўлади ва бунда метилирланган
(модификацияланган) ферментнинг хромосома ДНКсига эркин етиб
бориши таъминланади. Бундан ташқари, бу ҳужайрани унга
кирадиган ҳар қандай ДНК, масалан вирус ДНКси киришидан ҳимоя
қилади.
Хўжайин ДНКсини гетерологик рестрикция эндонуклеазалари
билан деградацияланиши муаммоларини ҳал қилиш учун
ёндашувлардан бири реципиент организмда рестрикция ферменти
гени каби мос келувчи модификацияловчи фермент генини ҳам
клонлаш ва экспрессиялашдан иборат. Бироқ мазкур икки генни бир
микроорганизмда клонлаш, агар улар донор организм хромосомасида
бир-биридан узоқ жойлашган бўлса, техник томондан қийинчилик
туғдиради. Бундан ташқари, хўжайин ДНКсининг рестрикция
эндонуклеазалари билан парчаланишига йўл қўймаслик учун,
96
метилирловчи фермент трансформациядан кейин рестриктаза
синтези бошлангунга қадар синтезланиб бўлиши лозим.
15.1 расмда
Do'stlaringiz bilan baham: |
