С. А. Эгамбердиева молекуляр

ишлов берилган плазмид 
ДНК 
керакли 
генни 
тутувчи рестрикцияланган 
донор 
ген 
билан 
аралаштирилади ва ДНК-
лигаза қўшилади. Бунда 
тўртта 
бир 
занжирли 
узилишлардан 
иккитаси 
бартараф 
этилади, 
ва 
конструкция ҳосил бўлган 
фосфодиэфир боғламлари 
туфайли 
мустаҳкам 
бўлади. 
Ҳужайра-
хўжайинга гибрид ДНК 
киритилгандан 
кейин 
унинг репликацияси содир 
бўлади ва узилишларсиз 
янги 
халқасимон 
молекулалар ҳосил бўлади.
(Глик ва Пастернак бўйича) 

---

59 
Трансформация ва танлаш 
Энди рекомбинант ДНКни ҳужайра-хўжайинга киритиш керак. 
Мазкур жараён трансформация деб аталади. Уни амалга ошириш 
учун махсус ишлаб чиқилган усуллардан фойдаланилади, масалан, 
ҳужайраларга юқори ҳарорат билан таъсир кўрсатилади ва уларга 
кальций хлориди (СаС1
2
) билан ишлов берилади. Бироқ шунда ҳам 
трансформация самарадорлиги унчалик баланд бўлмайди, одатда 
мингтанинг 
орасидан 
биттадан 
ортиқ 
ҳужайра 
трансформацияланмайди. Шундай қилиб, кўпчилик ҳужайраларда 
трансформациядан кейин рекомбинант ДНК бўлмайди. Уларнинг 
баъзиларида ишқорий фосфатаза ёрдамида дефосфорилланишдан 
четда қолган қайтадан бирлашган халқали плазмид ДНК пайдо 
бўлади, бошқаларида – плазмид бўлмаган ДНК ва фақат баъзиларида 
– бегона ДНК фрагменти киритилган плазмида (гибрид плазмида) 
пайдо бўлади. 
Айтиб ўтганимиздек, репликация бошланиш нуқтасига эга 
бўлмаган хромосомадан ташқари ДНК бактериал ҳужайрада 
репликациялана олмайди. Шундай қилиб, ҳужайрага экзоген 
ДНКнинг кириши ҳали хўжайин ҳужайрасида ушлаб турилади дегани 
эмас. Кейин рекомбинант ДНКни ҳужайра-хўжайинда дастлабки 
кўринишда сақлаб туриш учун ҳужайрада уни деградацияга олиб 
келувчи рестриктазаларни кодловчи генлар бўлмаслиги, ва 
ҳужайрада фенотип RecA
–
мавжуд бўлиши керак (бундай ҳужайралар 
умумий рекомбинацияланиш хусусиятига эга эмас, демак экзоген 
ДНК 
гомологик 
рекомбинация 
натижасида 
ўзгармайди 
(модификацияланмайди)). Кейин рекомбинант ДНК сақловчи 
ҳужайраларни идентификациялаш зарур. Идентификация усули 
имкон борича оддий бўлиши керак, чунки кўплаб ҳужайраларни 
текширишга тўғри келади.
Бегона ДНК 
Ваm
HI сайтига ўрнатиладиган pBR322 тизимида 
специфик идентификация икки босқичдан иборат. Дастлаб 
трансформациядан кейин ҳужайралар таркибида ампициллин бўлган 
озуқа муҳитига экилади. Бундай шароитларда ёки интакт 
(бузилмаган) pBR322 плазмида, ёки гибрид плазмиданинг таркибида 
Аmр
r
интакт 
гени 
бўлган 
ҳужайралар 
ўсиши 
мумкин; 
трансформацияланмаган ҳужайралар ампициллинга сезувчан бўлади. 
Bam
HI сайти pBR322 плазмиданинг Tet
r
генида жойлашган (расм 7.1); 

---

60 
мазкур генга ДНК фрагментининг ўрнатилиши кодловчи кетма-
кетликни узиб юборади, ва тетрациклинга чидамлилик йўқолади. 
Шундай қилиб, гибрид плазмида ташувчи ҳужайралар ампициллинга 
чидамли, лекин тетрациклинга сезувчан, pBR322 интакт плазмидани 
қабул қилган Tet
r
генини ташувчи ҳужайралар эса ампициллин каби 
тетрациклинга ҳам чидамли бўлади. 
Иккинчи босқичда иккала вариант ажратилади. Ампициллинли 
муҳитда ўстирилган ҳужайралар қайтадан босиш усули билан 
тетрациклинли муҳитга кўчириб ўтказилади. Тетрациклинли 
ликобчаларда колониялар ҳосил қилувчи ҳужайраларда pBR322 
интакт плазмидаси мавжуд, айтиб ўтганимиздек улар ампициллинга 
ҳам 
тетрациклинга 
ҳам 
чидамли 
бўлади. 
Тетрациклинли 
ликобчаларда ўсмаган ҳужайралар ушбу антибиотикка сезувчан, 
демак уларда pBR322 гибрид плазмидаси мавжуд. 
Ампициллинли 
муҳитда 
ўстирилган 
колониялардан 
тетрациклинга сезувчанлари ажратиб олинади ва ҳар бир колониядан 
индивидуал ҳужайравий клонлар ёки ампициллинга чидамли ва 
тетрациклинга сезувчан барча колониялар бирлаштирилади (кўпинча 
айнан шундай қилинади), ва улар биргаликда ўстирилади. Кейин 
қўшимча скрининг ўтказиш ва специфик киритмага (вставкага) эга 
pBR322 гибрид плазмида ташувчи ҳужайраларни идентификациялаш 
мумкин. pBR322 плазмиданинг Tet
r
генида 
HindIII
и 
SalI
сайти ва 
Аmр
r
генида 
Pst
I сайти бўлиши бегона ДНК клонланган 
фрагментларнинг жойлашувини ўзгартириш имконини беради. Агар 
ичига ўрнатиш учун 
Pst
I сайтидан фойдаланилса, у ҳолда танлов ўша 
схема бўйича, лекин ўзгача тартибда олиб борилади, яъни дастлаб 
ҳужайралар тетрациклинли, кейин эса – ампициллинли муҳитга 
экилади.