Практическое занятие №1

Лабораторная работа:
Анаэробный гликолиз в мышечной ткани.
Обнаружение в пробе молочной кислоты после инкубации глюкозы в присутствии ферментов мышечной кашицы свидетельствует о протекании гликолиза в мышце. Молочную кислоту можно открыть в реакции с вератролом (диметиловый эфир пирокатехина). Предварительно молочная кислота под действием крепкой серной кислоты превращается в уксусный альдегид, который при взаимодействии с вератролом дает окрашенное соединение.
Ход работы. 1. Приготовление инкубационной смеси. В две пробирки (опытную и контрольную) приливают по 3 мл фосфатного буфера рН 8,0 и по 1 мл 1%-ного раствора глюкозы. В контрольную пробирку приливают 1 мл 10%-ного раствора ТХУ для предотвращения действия ферментов гликолиза. Содержимое пробирок хорошо перемешивают.
В обе пробирки добавляют по 1 г измельченной ножницами свежеприготовленной мышечной кашицы и доливают по 8-10 капель вазелинового масла для разобщения инкубационной смеси с кислородом воздуха. Обе пробирки инкубируют в термостате при 37⁰ в течение 1,5 ч.
2. Осаждение белков. По окончании инкубации пробирки вынимают из термостата. В опытную пробирку добавляют 1 мл 10%-ного раствора ТХУ для осаждения белков и прекращения гликолиза. Содержимое каждой пробирки отфильтровывают в две чистые пронумерованные пробирки.
3. Осаждение углеводов. В две пробирки, содержащие безбелковый фильтрат, добавляют по 1 мл полунасыщенного раствора сульфата меди и по 0,5 г порошка гидроксида кальция. Пробирки закрывают пробками, встряхивают в течение 15 мин и фильтруют через фильтр, смоченный водой. Осадок на фильтре отбрасывают. С помощью этой процедуры удаляют избыток глюкозы из раствора.
4. Обнаружение молочной кислоты. Пробирки с фильтратом помещают в воду со льдом и медленно, по каплям, добавляют по 1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирки следует все время осторожно встряхивать и следить, чтобы их содержимое не нагревалось. Для ускорения процесса окисления молочной кислоты обе пробирки переносят в кипящую баню на 4 мин, а затем быстро охлаждают в ледяной воде. После охлаждения в каждую пробирку добавляют по 1-2 капли 0,1%-ного раствора вератрола, осторожно встряхивают несколько минут. В опытной пробе развивается ярко-розовое окрашивание, так как произошел гликолиз под влиянием ферментов мышечной ткани. В контрольной пробе окраска слабо-розовая за счет молочной кислоты, которая присутствовала в мышечной кашице до начала опыта.