O’zbekiston respublikasi oliy va o’rta maxsus ta’lim vazirligi qarshi Davlat universiteti Kimyo biologiya fakulteti biologiya yo’nalishi 018-60 gurux talabasi Abduraxmonova Dilbarning Bioinformatika fanidan tayyorlagan kursi sh I reja


CYP21genini amplifikatsiya qilish uchun ishlatilgan praymerlar



Download 0,73 Mb.
bet9/13
Sana20.06.2022
Hajmi0,73 Mb.
#683357
1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   13
Bog'liq
Muzaffarova Dilbar

CYP21genini amplifikatsiya qilish uchun ishlatilgan praymerlar:
Forward (U1-F) 5’-GAGTACCTTGGAGGGCCTGCT-3’;
Reverse (F3-R) 3’-GCTACACTCCAGCGTCTGAGG-5’.
PZR-amplifikastiyani o’tkazishda quyidagi dastur yordamida olib boriladi.
2- jadval. PZR-amplifikatsiyasini o’tkazish dasturi

Bosqich

Harorat,°C

Vaqt,min

Sikl

Denaturatsiya

95.0

4:00

1

94.0

0:20

45


Renaturatsiya

64.0

0:40

Elongatsiya

72.0

3:00

Yakunlovchi elongatsiya

72.0

5:00

1

Amplifikatsiya tugagandan so’ng, hamma probirkalarni elektroforez xonasiga ko’chiriladi va 5-10 mkl PZR mahsuloti 1,2 % elektroforez usuli bilan aniqlanadi.



  1. Agaroza gelida elektroforez qo’yish

Agaroza gelidagi elektroforez – standart metod bo’lib, DNK fragmentlarini tozalash, aniqlash va ajratishda foydalaniladi. Agaroza gelidagi elektroforezda TBE bufer sistemasi ishlatiladi. Bufer 121 g Tris, 55 g Bor kislota, 7,55 g EDTA moddalaridan tashkil topib, ular ozgina (500 ml) distillangan suv bilan magnitli aralashtirgich yordamida aralashtiriladi. So’ng 1 l ko’rsatkichigacha distillangan suv qo’shiladi. Bunda 10×TBE bufer tayyorlanadi va undan keyinchalik 0,5×TBE bufer tayyorlanadi. Bunda 500 ml 0,5×TBE bufer tayyorlash uchun 10×TBE buferdan 25 ml o’lchab olinadi va 500 ml gacha distillangan suv (dH2O) qo’shiladi.
Zonali elektroforezni olib borishda agar geli tashuvchi muhit hisoblanadi. 0,8-0,9% li agaroza gelida DNK fragmentlari erkin harakatlanadi.
CYP21 genining PZR-mahsuloti agaroza gelidagi elektroforezda tekshiriladi.
Agaroza geli quyidagicha tayyorlandi: 1,2 gramm agaroza va 100 ml 0,5×TBE ni 200 ml li toza kolbaga solib, mikroto’lqinli pechda eritiladi. Agaroza to’liq erigandan so’ng, 50-60°C gacha sovutiladi, etidium bromiddan 7 mkl solinadi (1mg/ml) va sekin-asta aralashtiriladi. So’ng biroz xona haroratiga qo’yiladi. Gelda o’yiqchalarni hosil qilish uchun taglikka taroqcha o’rnatiladi. Avval tayyorlab qo’yilgan forez tagliklariga agaroza gelini quyiladi. Agaroza geli xona haroratida 10-15 minutlardan keyin polimerlanadi. Gel elektroforez kamerasiga ko’chiriladi va 0,5xTBE–bufer solinadi (bufer gel yuzasini 0,3-0,5sm ga yopishi kerak). Geldagi o’yiqchalarga 3-10 mkl PZR mahsulotini bo’yoq (bromfenol-ko’ki, ksilentsianol) bilan aralashtirib solinadi. So’ngra elektroforezga 120 V energiya manbaiga ulanadi; 1-1,5 soat vaqt mobaynida kuzatiladi.
Agaroza gelining tiniqligi DNK fraktsiyalarini yaxshi bo’yashni va fotometrik uslubda aniqlashni osonlashtiradi.
Elektroforez tugaganidan so’ng, amplikonlar transillyuminator oynasida ultrabinafsha nurlari ta’sirida ko’riladi. Gelni suratga olishda kompyuterga ulangan transillyuminator (WiseDoc, Korea) dan foydalaniladi. Birinchi navbatda nazorat namunalari baholanadi. Elektroforetik yo’lakchada, musbat nazoratga muvofiq, oq chiziq bo’lishi kerak. Uning elektroforetik harakatchanligi amplikon uzunligi qo’llanmasiga mos bo’lishi kerak. Elektroforetik yo’lakchada manfiy nazoratda chiziq bo’lmaydi. Agar manfiy nazoratda qandaydir rang bo’lsa, bunday holda o’rganilayotgan DNK yoki amplikonga ishlatilgan reagentlarning ifloslanganligidan dalolat beradi. Demak, namunalardagi chiziqlarni musbat nazorat namunadagi chiziqlarga nisbatan taqqoslanadi. Chiziqni yoritilish intensivligi namunada o’rganilayotgan DNK ni miqdoriga mos bo’ladi va bu – PZR o’tkazilganligini baholashga imkon beradi. Agarda namunadagi chiziqni yorqinligi juda kuchsiz bo’lsa, bunday namunani qayta tekshirish zarur.
Gel-elektroforezda CYP21 genining PZR-mahsulotlari fragmentlarini intensivligiga qarab probirkalardagi PZR-mahsulotlari bir necha martagacha suyultirildi (distillangan suv bilan) va real vaqtdagi PZR-amplifikatsiya o’tkazishga tayyorlanadi.


  1. Download 0,73 Mb.

    Do'stlaringiz bilan baham:
1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   13




Ma'lumotlar bazasi mualliflik huquqi bilan himoyalangan ©hozir.org 2024
ma'muriyatiga murojaat qiling

kiriting | ro'yxatdan o'tish
    Bosh sahifa
юртда тантана
Боғда битган
Бугун юртда
Эшитганлар жилманглар
Эшитмадим деманглар
битган бодомлар
Yangiariq tumani
qitish marakazi
Raqamli texnologiyalar
ilishida muhokamadan
tasdiqqa tavsiya
tavsiya etilgan
iqtisodiyot kafedrasi
steiermarkischen landesregierung
asarlaringizni yuboring
o'zingizning asarlaringizni
Iltimos faqat
faqat o'zingizning
steierm rkischen
landesregierung fachabteilung
rkischen landesregierung
hamshira loyihasi
loyihasi mavsum
faolyatining oqibatlari
asosiy adabiyotlar
fakulteti ahborot
ahborot havfsizligi
havfsizligi kafedrasi
fanidan bo’yicha
fakulteti iqtisodiyot
boshqaruv fakulteti
chiqarishda boshqaruv
ishlab chiqarishda
iqtisodiyot fakultet
multiservis tarmoqlari
fanidan asosiy
Uzbek fanidan
mavzulari potok
asosidagi multiservis
'aliyyil a'ziym
billahil 'aliyyil
illaa billahil
quvvata illaa
falah' deganida
Kompyuter savodxonligi
bo’yicha mustaqil
'alal falah'
Hayya 'alal
'alas soloh
Hayya 'alas
mavsum boyicha


yuklab olish