O’zbekiston respublikasi oliy va o’rta maxsus ta’lim vazirligi qarshi Davlat universiteti Kimyo biologiya fakulteti biologiya yo’nalishi 018-60 gurux talabasi Abduraxmonova Dilbarning Bioinformatika fanidan tayyorlagan kursi sh I reja

Mutatsiya*	Praymer va zond nomlari**
Praymer va zondlar ketma-ketligi *** 5 ' 3'	Amplikon uzunligi j.n
C1994T	AW8-R	TTCGTGGTCTAGCTCCTCGTG	125
	AM8-R	GTTCGTGGTCTAGCTCCTCGTA
	A8- F	ACTCAGGCTCACTGGGTTGCT
	AP8	6FAMTGATCGGGTGGAGTCCTGCCBH1

* Nukleotidlarni raqamlash initsirlovchi ATG kodonidan boshlanadi.
** Allel spetsifik praymerlar, AW yovvoyi tip alleliga, AM mutant alleliga mos tushadi; F – to’g’ri , R – tekari praymer; AP – TaqMan zondi.
*** Matritsani nokomplementar nukleotidi.
PZR jarayonida renaturatsiya bosqichida DNK zondi DNKning komplimentar zanjiriga birikadi, qancha ko’p amplifikatsiya mahsuloti hosil bo’lsa, shuncha ko’p zond molekulasi o’ziga xos amplikonlar bilan birikadi. Elongatsiya bosqichida polimeraza komplementar DNK zanjirini sintezlaydi va zondga yetganda 5'-ekzonukleaza faolligi yordamida uni parchalaydi. Shunday qilib, fluorestsent belgi va o’chiruvchini ajralishi sodir bo’lib, detektrlanayotgan yorug’likni ko’payishiga olib keladi [17]. Ayonki, ayni vaqtda PZR davomida qanchalik ko’p amplikonlar ishlab chiqarilsa shunchalik yorug’lik intensiv bo’ladi.
Real vaqtdagi PZR-amplifikatsiya uchun kerakli reagentlar to’plami quyidagi funksiyalarni bajaradi: dd H ₂ O – erituvchi vazifasini bajarib, uning miqdori o’zgarib turadi. PCR Buffer pH muhitni barqarorlashtirib turadi. dNTP–erkin dezoksinukleotidtrifosfatlar (dNTP- dATP, dCTP, dGTP, dTTP) bo’lib, ular yangi DNK zanjiri uchun zarur. MgCl₂ – DNK zanjirini turg’unligini ta’minlab turadi. Praymer – com (F, R) – DNKning ikkinchi zanjirini sintezlaydi. Praymer – ( angl. primer) – nishon DNK yoki RNK ga komplimentar bo’lgan qisqa nuklein fragmenti (oligonukleotid) bo’lib, DNK-polimeraza yordamida komplimentar zanjirini sintezlash uchun “tomizg’i” sifatida xizmat qiladi. ”Tomizg’i” DNK-polimerazalar uchun yangi zanjirni praymerning 3'-uchidan (OH dan) sintezini inistiastiyasi uchun kerak. DNK-polimeraza praymerni 3'-uchiga matrista zanjiriga komplementar bo’lgan nukleotidlarni qo’shadi. Bu praymerlar umumiy. Primer – Wt (Mut) – bitta probirkaga yoki Wild type, yoki Mutant solinadi. Zond – Real vaqtdagi natijani olish uchun ahamiyatli va u flouressensiyani beradi . Har bir CYP21 geni mutatsiyalari uchun alohida zondlar ishlatiladi. Taq - polimeraza – DNK zanjiri sintezini ta’minlaydi.
Real vaqtdagi PZR-amplifikatsiya uchun quyidagi ketma-ketlikdagi ishlar qilinadi: avval 2 ta probirkalarga Master mix Mutant va Master mix Wild Type reaksiya aralashmalarini tayyorlab olinadi. Master mix Wild Type yovvoyi tip (mutatsiya yo’q) allelini aniqlash uchun qo’llaniladi. Master mix Mutant (mutatsiya bor) esa mutant allelini aniqlash uchun qo’llaniladi. Mutant allel va yovvoyi tip allelini aniqlash uchun allel-spetsifik oligonukleotidli praymerlar va amplikonga mos keluvchi Taq-Man zondi ishlab chiqarilgan. Fluorofor sifatida 6-karboksifluoresten (FAM) yoki karboksi-X-rodamin (ROX) ishlatiladi. Ikkala probirkaga ham com praymeri ishlatiladi.

9-rasm. Real vaqtdagi PZR da hosil bo’lgan amplikonlar
Buning uchun har ikki probirkalarga 7.4mkl dan dd H ₂ O solinadi ,ustiga esa 10x PCR Buffer dan 1.5 mkl dan solinadi, keyin dNTP dan 1.5 mkl solinib, ustidan MgCl₂ dan ham 1.5 mkl miqdorda solinadi, yana Praymer com (Forward (A8_ACTCAGGCTCACTGGGTTGCT) dan 0.6mkl solinadi, keyin esa Master Mix WT probirkasi uchun praymer Wild Type AW8_R TTCGTGGTCTAGCTCCTCGTG praymeri ishlatilsa, Master Mix Mutant uchun esa AM8_R GTTCGTGGTCTAGCTCCTCGTA praymeri ishlatiladi. Bulardan mos ravishda 0.6mkl dan solinadi. Aniq natijaga erishish uchun esa zonddan 0.6mkl solinadi. Taq- polimeraza fermentidan esa 0.1mkl miqdorda solinadi. Hosil bo’lgan umumiy miqdordan mos ravishda probirkalarga 13.8 mkl dan Master mix Mutant va Master mix WT lardan solib, ustiga esa 1.2 mkl dan PZR-mahsulotdan solinadi. Keyin esa Real vaqtdagi (Real-time PCR) PZR-amplifikatorga joylashtiramiz.
Real vaqtdagi PZR-amplifikatsiyani o’tkazishda quyidagi dastur yordamida olib boriladi. (4-jadval)
4- jadval. Real vaqtdagi PZR-amplifikatsiyasini o’tkazish dasturi

Bosqich	Harorat,°C	Vaqt,min	Sikl
Denaturatsiya	95.0	5:00	1
Renaturatsiya	66.0	0:50	40
Denaturatsiya	95.0	0:15

PZR-amplifikatsiya yordamida CYP21 funksional genini tanlangan amplifikatsiya qilishga imkon beradi. CYP21 genining amplifikatsiyasi uchun bizda lokus-spetsifik praymerlar ishlab chiqarilgan va lekin bu praymerlar psevdogen uchun emas. Keyingi bosqichda elektroforez uslubi orqali PZR mahsuloti tekshirildi[18].
PZR mahsulotining elektroforez tahlili shuni ko’rsatdiki, uni uzunligi kutilgan 3293 j.n ga mos keldi (10-rasm). Hosil qilingan bunday PZR mahsulot namunasi yana mutatsiyani topib tadqiq qilishga asoslangan allel-spetsifik real vaqtdagi PZR da matritsa sifatida ishlatiladi [19].
.
10-rasm. CYP21 geni PZR mahsulotining elektroforezdagi natijasi.
Bunda 1-8 gacha bo’lgan PZR namunalari bo’lib, ularda 3293 j.n.dagi PZR mahsuloti hosil bo’ldi.
Real vaqtdagi PZR-amplifikatsiya o’tkazilganda quyidagi natijalar olindi: TBGP kasalligining klinik belgilari namoyon bo’lgan 20 ta bemorlarning DNK namunasidan 17 ta (85%) C/C, 2 ta (10%) C/T va 1 ta (5%) T/T polimorfizmlari aniqlandi.
Bu yerda:
C/C – polimorfizmni gomozigota shakldagi normal variant;
C/T - polimorfizmni geterozigota shakli;
T/T – polimorfizmini kasalliklar xavfini oshishi bilan bog’liq bo’lgan gomozigota shaklidagi mutant variant.
Bunda , C1994T mutatsiyasi aniqlanmagan holatdagi rasm ko’rsatilgan.

11-rasm. C1994T mutatsiyasini aniqlash uchun PZR mahsulotlarini to’planishi

12-rasm. C1994T mutatsiyasini aniqlash uchun PZR mahsulotlarini to’planishi
12-rasmda Geterozigotali (C/T) grafiki ko’rsatilgan.

13-rasm. C1994T mutatsiyasini aniqlash uchun PZR mahsulotlarini to’planishi
Bunda , C1994T mutatsiyasi gomozigota holatdagi rasmi ko’rsatilgan.

Shaxsga oid tibbiyotda ishlatilishi

Ayrim hollarda dorilar ba’zi bemorlar uchun toksik yoki allergik ta’sir etishi mumkin. Buning sababi- dorilar va ularning mahsulotlariga nisbatan individual ta’sirchanlikning turli-tumanligidir. Bu turli-tumanlik genetik darajada baholanadi. Masalan, bir bemordagi sitoxrom (jigar oqsili bo’lib, yot moddalar metabolizmiga javob beradi) nisbatan ko’proq faol bo’lsa, boshqa bemorda esa nisbatan kamroq bo’lishi mumkin. Buning uchun bemorlarda sitoxromlarning turli-tuman bo’lishini inobatga oladigan bo’lsak, dori qo’llanilishidan avval PZR tahlili o’tkazilishi tavsiya qilinadi. Bunday tahlil dastlabki genotipirlash deyiladi (angl.prospective genotyping).
Genlarni klonlashda ishlatilishi
Genlarni klonlash (organizmlarni klonlash bilan adshtirmaslik kerak) – genlarni ajratib olish jarayoni bo’lib, gen injenerligi manipulyatsiyasi natijasida ushbu genning katta miqdordagi mahsulotini hosil qilishdan iborat. PZR genni amplifikatsiya qilib, keyin DNK fragmenti vektorga o’rnatiladi, yot genni tashib yuruvchi vektor organizmni yetishtirish uchun qulay hisoblanadi. Vektor sifatida plazmida yoki virus DNK si ishlatiladi. Yot organizmga genni qo’yishda odatda bu genning mahsulotini hosil qiluvchilari ya’ni – RNK, ko’proq oqsil hosil qiluvchilar ishlatiladi. Shunday qilib, qishloq xo’jaligida, tibbiyotda ishlatish uchun ko’pgina oqsillar shu yo’l bilan hosil qilinadi.

14-Rasm. Plazmida ishlatish bilan klonlangan gen olish.

1. 
   A organizmning xromosoma DNKsi;
   
2. 
   PZR o’tkazilgach hosil bo’lgan fragmentlar;
   
3. 
   A organizmning ko’plab gen nusxalari;
   
4. 
   Genni plazmidaga o’rnatish;
   
5. 
   A organizmning genomi bilan plazmida;
   
6. 
   Plazmidani B organizmga kiritish;
   
7. 
   B organizmda A organizmning genlari nusxalarini ko’payishi.