Олий ва ўрта махсус таълим вазирлиги ўзбекистон республикаси қишлоқ ХЎжалиги вазирлиги тошкент давлат аграр университети

Вирусларни аниқлаш

Вируслар ва фитоплазмаларни аниқлаш учун қуйидаги тадқиқотларни ўтказиш лозим: касаллик симптомларини аниқлаш; ўсимликда касаллик

74
мавжудлигини аниқлаш; касаллик тарқалиши усули (векторлар мавжуд бўлса, уларнинг турлари) ни аниқлаш; зарарланадиган ўсимлик турлари доирасини аниқлаш; индикатор ўсимликларни зарарлаш усулини қўллаш; физик хусусиятлари (термал инактивация нуқтаси; in vitro сақланиш муддати; фаоллигини сақловчи охирги суюлтириш концентрацияси) ни аниқлаш; вирионларнинг шакли, узунлиги ва эни; нуклеин кислотасининг типини аниқлаш; молекуляр-биологик методларни (полимераза занжирли реакцияси ёрдамида РНК нинг тур учун специфик нуклеотид кетма-келикларини амплификация қилиш ва тест натижаларини гель электрофорези ёки иммунофлуоресценция ёрдамида аниқлаш) қўллаш; серологик анализ ўтказиш.

Вируслар диагностикасида визуал метод ёрдамида касалликнинг ташқи белгилари аниқланади. Аммо вирус штамми, хўжайин ўсимлик нави, атроф-муҳит шароитлари билан боғлиқ ҳолда вирозларнинг белгилари жуда ўзгарувчан бўлиб, бундай белгиларнинг баъзилари бошқа биотик (масалан, шира, саратон ва бошқа зарарли ҳашаротлар билан зарарланиш натижасида) ва абиотик факторлар (масалан, тупроқда темир, магний, марганец етишмаслиги ёки хлор кўп бўлиши, ўсимлик баргларига бехосдан гербицид тушиши) таъсирида ҳам ривожланиши мумкин.

Ўсимликда вироз мавжудлигини аниқлаш учун бир неча усуллар қўлланилади: а) вироз билан зарарланганлиги гумон қилинган ўсимлик намунасига бироз 0,1 М фосфат буферини қўшиб, намунадан бироз шира сиқиб олинади, унга яна бироз инфекцияни барқарорловчи материал (масалан, натрий сульфатнинг 0,1% ли эритмаси) солиб, шира 2 қат докадан сузиб олинади. Кейин бу ширага озгина карборунд қўшиб, соғлом ўсимликка ишқаланади. Сунъий зарарланган ўсимликлар изоляторга қўйилади ва касаллик белгилари пайдо бўлгунигача (ўсимлик ва вирус тури билан боғлиқ ҳолда – 3 кундан 30 кунгача) кузатиб борилади. Бу усул ёрдамида контакт усулда тарқаладиган вирозларни аниқлаш мумкин; б) пайванд усули қўлланилади, бунда вироз билан зарарланганлиги гумон қилинган ўсимлик
75
қисми пайвандтаг ёки пайвандуст шаклида олинади; в) вектор ҳашаротлар

қўлланилади. Бунда соғлом вектор ҳашаротлар вироз билан зарарланганлиги

гумон қилинган ўсимликда муайян муддат (персистент вируслар учун 3-7

кун, ноперсистент вируслар учун эса бир неча минут) давомида

озиқлантирилади ва кейин изоляторда соғлом ўсимликка қўйиб юборилади,

сўнгра ўсимликда вироз симптомлари пайдо бўлиши кузатиб борилади;

г) зарпечак қўлланилади, бунда паразит айни пайтда ҳам вироз билан

зарарланганлиги гумон қилинган ўсимликда, ҳам соғлом ўсимликда ўсиши

лозим. Касаллик вирус билан зарарланганлиги тасдиқлангач, вирус турини

аниқлаш талаб қилинади

Индикатор ўсимликларни қўллаш. Индикатор ўсимликлар – муайян вирус билан сунъий зарарлаганда уларда яхши кўринадиган, специфик касаллик белгилари пайдо бўладиган ўсимликлардир. Бундай ўсимликлар вирусларнинг кўп турлари учун танлаб олинган ва бу усул амалиётда кўп ишлатилади. Соғлом индикатор ўсимликлар олиш учун, улар изоляторда ўстирилади ва 3-4 барг фазасида сунъий зарарлантирилади. Кўпинча юқорида баён этилган шира сиқиб олиб, механик зарарлаш усули қўлланилади. Кейин зарарланган индикатор ўсимликлар 4 ҳафта давомида кузатилади. Вирус билан зараланган индикатор ўсимликларда 3 хил симптомлар ривожланиши мумкин: локал реакция (вироз белгилари фақат инокуляция қилинган баргларда пайдо бўлади); системали реакция (симптомлар ўсимликнинг ҳар хил қисмларида, мозаика, деформация, некротик доғлар шаклида ривожланади); аралаш реакция (вироз белгилари олдин инокуляция қилинган баргларда пайдо бўлиб, кейин ўсимликнинг барча қисмларига системали тарқалади).


Серологик усул. Юқорида кўрсатилган усуллар ёрдамида вирусларни тадқиқ қилиш учун хўжайин ўсимлик бўлиши гумон қилинган ўсимликларни ва/ёки индикатор ўсимликларни сунъий зарарлаш, вируснинг соф препаратларини ажратиб олиш, бу препаратларни электрон микроскоп ёрдамида текшириш, махсус, баҳоси қиммат бўлган реактивларни қўллаш
76
ҳамда тадқиқотларни ўтказишга жуда кўп вақт ва маблағ сарфлашга тўғри келади Аммо бу усуллар ёрдамида вирус турини фақат тахминан аниқлаш мумкин. Вирус турларини фақат серологик усул (жумладан иммунофермент анализ - ELISA) ёрдамида ишончли ва нисбатан тез (кўпи билан 1-2 кун орасида) аниқлаш мумкин ва бу усул фитовирусология амалиётида жуда кенг қўлланилади. Бу усулнинг моҳияти шундаки, бирор ҳайвоннинг қонига ушбу ҳайвон учун бегона оқсил киритилса, унинг организмида махсус, антитело (агглютинин, преципитин) лар деб аталадиган оқсил таначалари ҳосил бўлади. Антителолар бегона оқсилни бойлаб, инсон ёки ҳайвон организми учун зарарсиз ҳолатга келтиради (инсон ва ҳайвонларнинг юқумли касалликларга иммунитети асосида ушбу ажойиб ҳодиса ётади). Ҳайвон организмига киритилганида антителолар ҳосил бўлишига олиб келадиган модда (бегона оқсил ва б.) антиген деб аталади, антиген билан зардобдаги антителолар орасидаги реакция эса серологик реакция (преципитация ёки агглютинация реакцияси) дейилади.

Антителолар қуйидаги хусусиятларга эга: а) антителолар юқори

даражада специфик ва фақат улар ҳосил бўлишига асос бўлган ёки уларга

жуда яқин бўлган антигенлар билангина реакцияга киради; б) улар ўта сезгир

бўлиб, антигеннинг жуда кам миқдорлари билан ҳам реакцияга киради;

в) улар организмда катта миқдорда ҳосил бўлиб, барча антигенлар

зарарсизлантирилгандан кейин ҳам кўп антителолар организмда эркин

ҳолатда қолади; г) улар нафақат ҳайвон организмида (in vivo), балки ҳайвон

организмидан ажратиб олинганида ҳам (in vitro) антиген билан реакцияга

киради.

Серологик анализ антителоларнинг ушбу хусусиятларига асосланади. Бошқа микроорганизмлар ҳамда бегона ҳайвон ва ўсимлик оқсиллари каби вируслар ҳам ҳайвон (қуён, от ва ҳ.) қонига киритилганида, унинг қонининг плазмаси (зардоби) да антителолар тўпланишини таъминлайди. Бунда муайян вирус киритилса, зардобда фақат ушбу вирус учун специфик антителоларнинг катта миқдорлари ҳосил бўлади. Ўсимликда ушбу вирус
77
мавжудлигини аниқлаш учун унинг шираси ишлов берилган ҳайвон зардоби билан аралаштирилади. Агар ўсимликда вирус мавжуд бўлмаса, аралашма лойқа ҳолатида қолади, вирус мавжуд бўлганида эса антиген ва антитело орасида реакция бўлиб, аралашмада пағасимон чўкма (преципитат) ҳосил бўлади. Серологик анализнинг мисоли М.С. Дунин ва Н.Н. Поповаларнинг томчи анализи бўлиб, бунда таҳлилдаги ўсимлик шираси ва ишлов берилган (синов) ва берилмаган (назорат) ҳайвонлар зардобларининг томчиларини буюм шишасида аралаштиришга асосланган. Бунда синов ижобий натижа берса (ўсимликда антиген – вирус мавжуд бўлса), 1-3 мин орасида преципитат ҳосил бўлади.

Серологик усулнинг сезгирлигини янада ошириш мақсадида иммунофермент анализ методи ишлаб чиқилган. Бунда муайян вирусга специфик антителоларга фермент уланади ва конъюгат номли комплекс олинади. Конъюгатга вирус билан зарарланган ўсимликнинг шираси қўшилади. Фермент билан “тамғаланган” (меченўе ) антителолар вирус-антиген билан рекцияга киради. Антиген антителолар томонидан адсорбция қилиниши натижасида антителога уланган фермент нофаол ҳолатга келади. Вирус билан реакцияга кирмаган антителолардаги фермент эса фаол ҳолатда қолади. Сўнгра ушбу фермент таъсир қиладиган субстрат солинади. Реакцияга кирган фермент миқдори колориметрия (маҳсулот рангининг ўзгаришини ўлчаш) ёрдамида аниқланади. Вирус мавжудлиги ва унинг концентрацияси тажриба ва назорат вариантларида фермент фаоллиги пасайишини солиштириш асосида аниқланади. Бу усулнинг аниқлиги томчи усулидан бир неча баравар устунлиги учун кўп мамлакатларда кенг қўлланилади.