II. TADQIQOT USULLARI
2.1. Hayvonlarni yuqori haroratda saqlash va tajriba o’tkazish sharoitlari
Tajriba uchun og’irligi 180-200 g li oq laboratoriya kalamushlardan foydalanildi.
Tadqiqot o’tkazish uchun olingan hayvonlarni har bir guruhda 8 tadan 4 ta guruhga
bo’lib o’rganildi. Birinchi guruhdagi kalamushlar 22-24
0
C da va ikkinchi
guruhdagilar 41-42
0C
da saqlandi. Birinchi guruhdagi kalamushlar tanasiga
fiziologik eritma teri ostiga yuborildi; ikkinchi guruhdagilarning tanasiga α-
tokoferolning 50 mg. ini hayvonning 1kg og’irligiga nisbatan yuborildi,
[Balashova T.S., Xitrov N.K., Gerasimov A.M., 1990; Meerson F.Z., Lapshin
A.V., Manuxina Ye.B., 1991; Sharigin V.L., Pulatova M.K., Shlyakova T.G.,
Mitroxin Yu.I., Todorov I.N., 2005]. Oradan 60 daqiqa o’tgach kalamushlarning
jigaridan mitoxondriyalar ajratib olinib nafas olishi va oksidlanishli fosforlanishi
aniqlandi.
Tadqiqot o’tkazish uchun olingan hayvonlarni har bir guruhda 10 tadan 2 ta
guruhga bo’lib o’rganildi. Birinchi guruhdagi kalamushlar tanasiga fiziologik
eritma teri ostiga yuborildi; ikkinchi guruhdagilarning tanasiga 50 mg. α-
tokoferolni hayvonning 1 kg og’irligiga nisbatan yuborildi [Balashova T.S., Xitrov
N.K., Gerasimov A.M., 1990; Meerson F.Z., Lapshin A.V., Manuxina E.B., 1991;
Sharigin V.L., va b., 2005]. Oradan 60 daqiqa o’tgach kalamushlarning yuragidan
mitoxondriyalar ajratib olinib nafas olishi, oksidlanishli fosforlanishi va oqsil
miqdori aniqlandi.
2.2. Jigardan mitoxondriyalarni ajratib olish
Kalamushlarning jigarlaridan mitoxondriyalar [Hageboom O.N., Scheider
W.C., Pallade O.H., 1948] taklif etgan usulda differensial sentrifuga yordamida
hamda Almatov K.T., Axmerov R.N., Zaripov B.Z., Irgashev M.S., Allamuratov
Sh.I., 1993a] tomonidan kiritilgan ayrim o’zgarishlar bilan ajratilib olindi.
Dekapitatsiya qilingan hayvonning qorin bo’shligi ochilib, jigar qirqib
olingandan keyin stakanga solindi. Stakanga tarkibi 0,25M saharoza, 2 mM EDTA
va 10mM tris-Hcl (pH 7,4)lardan tashkil topgan ajratish muhiti (0-1
0C
atrofida
36
sovutilgan) quyildi. Ajratish muhitiga etilendiamintetraatsetatni (EDTA)
qo’shishdan maqsad kalsiy kationini bog’lab olish. Chunki gipertireozda
hujayralarga kalsiyning kirishini kuchayishi u yerdagi fosfolipazalarning
faolliklarini va lipidlarning perekisli oksidlanishini kuchaytirib yuboradi.
Mitoxondriyalarni
ajratish
jarayonida
bu
sanab
o’tilgan jarayonlarni
mitoxondriyalarni strukturasi va funktsiyalariga salbiy ta’sirini to’xtatish uchun,
ya’ni in vivo sharoitidagi holatni saqlab qolish uchun EDTA kerak bo’ladi
[Almatov K.T., 1990]. Stakandagi jigar qaychi bilan bir nechta bo’laklarga bo’lindi
va qondan tozalandi. Jigar bo’laklarini bir joyga to’plab, ularning og’irligi tarozida
tortiladi va diametri 1mm li mikromaydalagichdan bosim ostida o’tkazildi.
Mikromaydalagichdan
o’tgan
jigar
molibden
shishadan
tayyorlangan
gomogenizatorga solindi va ustiga 1:10 nisbatda (1g jigar to’qimasiga 10ml)
sovutilgan ajratish muhitidan quyilib, teflonli ―pestik‖ bilan 50-60 soniya
davomida gomogenizatsiya qilindi. Gomogenatni polietilendan tayyorlangan
sentrifuga probirkalariga solindi. Birinchi probirkaga normal kalamushlarning jigar
gomogenati ikkinchi probirkaga oddiy suv solindi. Probirkalar tarozida tortilib bir
xil og’irlikka keltirildi va sentrifugani (TSLR-1) uyachalariga qarama-qarshi
holatda joylashtirildi. Sentrifuga rotori 10 daqiqa davomida (bir daqiqada 1700-
1800 aylanish tezligida) 600g tezlikda aylantirildi. Natijada gomogenizatsiya
paytida parchalanmay qolgan hujayralar va yadrolar cho’kmaga tushadi. Cho’kma
ustidagi suyuqlikni (supernatantni) toza probirkaga quyilib yana tarozida tortildi va
ikkala probirkalar bir xil og’irlikka keltirildi. (Probirkalarni og’irligini tenglashda
ajratish muhitidan foydalanildi).
Probirkalar sentrifuga rotoridagi uyachalariga qarama-qarshi holatda
joylashtirilib 15 daqiqa davomida 6000g tezlikda (1 daqiqada 5500-6000 aylanish
tezligida) sentrifuga qilindi. Bunda og’ir va o’rtacha og’irlikdagi mitoxondriyalar
cho’kmaga tushadi.
Supernatantda esa yengil mitoxondriyalar va mikrosomalar qoladi. Supertant
to’kib tashlandi va cho’kma ustiga pipetkada 2-3 ml ajratish muhiti probirka
devoriga tekizilib ohistalik bilan quyiladi (cho’kmadagi mitoxondriya chayqalib
37
ketmasligi uchun) va asta-sekinlik bilan quyilgan suyuqlik to’kib tashlandi. Buning
natijasida probirka devorlarida yopishib qolgan mikrosoma va yengil
mitoxondriyalar, hamda to’qimadagi har xil enzimlar yuvilib cho’kmadagi
mitoxondriyalar tozalandi. Undan keyin, yana probirkaga 1-2ml EDTA siz ajratish
muhiti solinib avvaldan sovutilib quyilgan shisha tayoqcha bilan cho’kmadagi
mitoxondriyalar yaxshilab aralashtirilib bir xil holatga keltirildi. Bunda 1ml
mitoxondriyada 70-80mg oqsil bo’lishiga erishish kerak. Mitoxondriyalarni ajratib
olish texnologiyasi boshidan to ohirigacha 1-2
0
C atrofida olib borilsa intakt, ya’ni
ATF sintezlash qobiliyatini saqlagan mitoxondriyalar ajratib olinadi. Sentrifuga
rotoridagi harorat 1-2
0
C atrofida bo’lishi kerak. Yaxshilab aralashtirilgan
mitoxondriyalarni nafas olish va oksidlanishli fosforlanishini aniqlash uchun 2-4
0
C
haroratda saqlandi.
Kalamushlarning
yuragidan
mitoxondriyalar
differensial
sentrifuga
yordamida [Almatov K.T. va b. 1993 a] ajratilib olindi.
Dekapitatsiya qilingan hayvonning ko’krak bo’shligi ochilib, yurak qirqib
olingandan keyin stakanga solindi. Stakanga tarkibi 0,25M saharoza va 10mM tris-
Hcl (pH 7,4)lardan tashkil topgan ajratish muhiti (0-1
0
C atrofida sovutilgan)
quyildi. Stakandagi yurak qaychi bilan bir nechta bo’laklarga bo’lindi va qondan
tozalandi. Yurak bo’laklarini bir joyga to’plab, ularning og’irligi tarozida tortiladi
va
diametri
1mm
li
mikromaydalagichdan
bosim
ostida
o’tkazildi.
Mikromaydalagichdan
o’tgan
jigar
molibden
shishadan
tayyorlangan
gomogenizatorga solindi va ustiga 1:10 nisbatda (1g yurak to’qimasiga 10ml)
sovutilgan ajratish muhitidan quyilib, teflonli ―pestik‖ bilan 50-60 soniya
davomida gomogenizatsiya qilindi. Gomogenatni polietilendan tayyorlangan
sentrifuga probirkalariga solindi. Birinchi probirkaga normal kalamushlarning
yurak gomogenati ikkinchi probirkaga oddiy suv solindi. Probirkalar tarozida
tortilib bir xil og’irlikka keltirildi va sentrifugani (TSLR-1) uyachalariga qarama-
qarshi holatda joylashtirildi. Sentrifuga rotori 10 daqiqa davomida (bir daqiqada
1700-1800 aylanish tezligida) 600g tezlikda aylantirildi. Natijada gomogenizatsiya
paytida parchalanmay qolgan hujayralar va yadrolar cho’kmaga tushadi. Cho’kma
38
ustidagi suyuqlikni (supernatantni) toza probirkaga quyilib yana tarozida tortildi va
ikkala probirkalar bir xil og’irlikka keltirildi. (Probirkalarni og’irligini tenglashda
ajratish muhitidan foydalanildi).
Probirkalar sentrifuga rotoridagi uyachalariga qarama-qarshi holatda
joylashtirilib 30 daqiqa davomida 6000g tezlikda (1 daqiqada 5500-6000 aylanish
tezligida) sentrifuga qilindi. Bunda og’ir va o’rtacha og’irlikdagi mitoxondriyalar
cho’kmaga tushadi.
Supernatantda esa yengil mitoxondriyalar va mikrosomalar qoladi. Supertant
to’kib tashlandi va cho’kma ustiga pipetkada 2-3 ml ajratish muhiti probirka
devoriga tekizilib ohistalik bilan quyiladi (cho’kmadagi mitoxondriya chayqalib
ketmasligi uchun) va asta-sekinlik bilan quyilgan suyuqlik to’kib tashlandi. Buning
natijasida probirka devorlarida yopishib qolgan mikrosoma va yengil
mitoxondriyalar, hamda to’qimadagi har xil enzimlar yuvilib cho’kmadagi
mitoxondriyalar tozalandi. Undan keyin, yana probirkaga 1-2ml ajratish muhiti
solinib avvaldan sovutilib qo’yilgan shisha tayoqcha bilan cho’kmadagi
mitoxondriyalar yaxshilab aralashtirilib bir xil holatga keltirildi. Bunda 1ml
mitoxondriyada 70-80mg oqsil bo’lishiga erishish kerak. Mitoxondriyalarni ajratib
olish texnologiyasi boshidan to oxirigacha 1-2
0
C atrofida olib borilsa intakt, ya’ni
ATF sintezlash qobiliyatini saqlagan mitoxondriyalar ajratib olinadi. Sentrifuga
rotoridagi harorat 1-2
0
C atrofida bo’lishi kerak. Yaxshilab aralashtirilgan
mitoxondriyalarni nafas olish va oksidlanishli fosforlanishini aniqlash uchun 2-4
0
C
haroratda saqlandi.
Do'stlaringiz bilan baham: |