Namangan davlat universiteti tabiiy fanlar va geografiya fakultet

II. TADQIQOT USULLARI 
2.1. Hayvonlarni yuqori haroratda saqlash va tajriba o’tkazish sharoitlari 
Tajriba uchun og’irligi 180-200 g li oq laboratoriya kalamushlardan foydalanildi. 
Tadqiqot o’tkazish uchun olingan hayvonlarni har bir guruhda 8 tadan 4 ta guruhga 
bo’lib o’rganildi. Birinchi guruhdagi kalamushlar 22-24
0
C da va ikkinchi 
guruhdagilar 41-42
0C
da saqlandi. Birinchi guruhdagi kalamushlar tanasiga 
fiziologik eritma teri ostiga yuborildi; ikkinchi guruhdagilarning tanasiga α-
tokoferolning 50 mg. ini hayvonning 1kg og’irligiga nisbatan yuborildi, 
[Balashova T.S., Xitrov N.K., Gerasimov A.M., 1990; Meerson F.Z., Lapshin 
A.V., Manuxina Ye.B., 1991; Sharigin V.L., Pulatova M.K., Shlyakova T.G., 
Mitroxin Yu.I., Todorov I.N., 2005]. Oradan 60 daqiqa o’tgach kalamushlarning 
jigaridan mitoxondriyalar ajratib olinib nafas olishi va oksidlanishli fosforlanishi 
aniqlandi. 
Tadqiqot o’tkazish uchun olingan hayvonlarni har bir guruhda 10 tadan 2 ta 
guruhga bo’lib o’rganildi. Birinchi guruhdagi kalamushlar tanasiga fiziologik 
eritma teri ostiga yuborildi; ikkinchi guruhdagilarning tanasiga 50 mg. α-
tokoferolni hayvonning 1 kg og’irligiga nisbatan yuborildi [Balashova T.S., Xitrov 
N.K., Gerasimov A.M., 1990; Meerson F.Z., Lapshin A.V., Manuxina E.B., 1991; 
Sharigin V.L., va b., 2005]. Oradan 60 daqiqa o’tgach kalamushlarning yuragidan 
mitoxondriyalar ajratib olinib nafas olishi, oksidlanishli fosforlanishi va oqsil 
miqdori aniqlandi.
 
2.2. Jigardan mitoxondriyalarni ajratib olish 
Kalamushlarning jigarlaridan mitoxondriyalar [Hageboom O.N., Scheider 
W.C., Pallade O.H., 1948] taklif etgan usulda differensial sentrifuga yordamida 
hamda Almatov K.T., Axmerov R.N., Zaripov B.Z., Irgashev M.S., Allamuratov 
Sh.I., 1993a] tomonidan kiritilgan ayrim o’zgarishlar bilan ajratilib olindi. 
Dekapitatsiya qilingan hayvonning qorin bo’shligi ochilib, jigar qirqib 
olingandan keyin stakanga solindi. Stakanga tarkibi 0,25M saharoza, 2 mM EDTA 
va 10mM tris-Hcl (pH 7,4)lardan tashkil topgan ajratish muhiti (0-1
0C
atrofida 

---

36 
sovutilgan) quyildi. Ajratish muhitiga etilendiamintetraatsetatni (EDTA) 
qo’shishdan maqsad kalsiy kationini bog’lab olish. Chunki gipertireozda 
hujayralarga kalsiyning kirishini kuchayishi u yerdagi fosfolipazalarning 
faolliklarini va lipidlarning perekisli oksidlanishini kuchaytirib yuboradi. 
Mitoxondriyalarni 
ajratish 
jarayonida 
bu 
sanab 
o’tilgan jarayonlarni 
mitoxondriyalarni strukturasi va funktsiyalariga salbiy ta’sirini to’xtatish uchun, 
ya’ni in vivo sharoitidagi holatni saqlab qolish uchun EDTA kerak bo’ladi
[Almatov K.T., 1990]. Stakandagi jigar qaychi bilan bir nechta bo’laklarga bo’lindi 
va qondan tozalandi. Jigar bo’laklarini bir joyga to’plab, ularning og’irligi tarozida 
tortiladi va diametri 1mm li mikromaydalagichdan bosim ostida o’tkazildi. 
Mikromaydalagichdan 
o’tgan 
jigar 
molibden 
shishadan 
tayyorlangan 
gomogenizatorga solindi va ustiga 1:10 nisbatda (1g jigar to’qimasiga 10ml) 
sovutilgan ajratish muhitidan quyilib, teflonli ―pestik‖ bilan 50-60 soniya 
davomida gomogenizatsiya qilindi. Gomogenatni polietilendan tayyorlangan 
sentrifuga probirkalariga solindi. Birinchi probirkaga normal kalamushlarning jigar 
gomogenati ikkinchi probirkaga oddiy suv solindi. Probirkalar tarozida tortilib bir 
xil og’irlikka keltirildi va sentrifugani (TSLR-1) uyachalariga qarama-qarshi 
holatda joylashtirildi. Sentrifuga rotori 10 daqiqa davomida (bir daqiqada 1700-
1800 aylanish tezligida) 600g tezlikda aylantirildi. Natijada gomogenizatsiya 
paytida parchalanmay qolgan hujayralar va yadrolar cho’kmaga tushadi. Cho’kma 
ustidagi suyuqlikni (supernatantni) toza probirkaga quyilib yana tarozida tortildi va 
ikkala probirkalar bir xil og’irlikka keltirildi. (Probirkalarni og’irligini tenglashda 
ajratish muhitidan foydalanildi). 
Probirkalar sentrifuga rotoridagi uyachalariga qarama-qarshi holatda 
joylashtirilib 15 daqiqa davomida 6000g tezlikda (1 daqiqada 5500-6000 aylanish 
tezligida) sentrifuga qilindi. Bunda og’ir va o’rtacha og’irlikdagi mitoxondriyalar 
cho’kmaga tushadi. 
Supernatantda esa yengil mitoxondriyalar va mikrosomalar qoladi. Supertant 
to’kib tashlandi va cho’kma ustiga pipetkada 2-3 ml ajratish muhiti probirka 
devoriga tekizilib ohistalik bilan quyiladi (cho’kmadagi mitoxondriya chayqalib 

---

37 
ketmasligi uchun) va asta-sekinlik bilan quyilgan suyuqlik to’kib tashlandi. Buning 
natijasida probirka devorlarida yopishib qolgan mikrosoma va yengil 
mitoxondriyalar, hamda to’qimadagi har xil enzimlar yuvilib cho’kmadagi 
mitoxondriyalar tozalandi. Undan keyin, yana probirkaga 1-2ml EDTA siz ajratish 
muhiti solinib avvaldan sovutilib quyilgan shisha tayoqcha bilan cho’kmadagi 
mitoxondriyalar yaxshilab aralashtirilib bir xil holatga keltirildi. Bunda 1ml 
mitoxondriyada 70-80mg oqsil bo’lishiga erishish kerak. Mitoxondriyalarni ajratib 
olish texnologiyasi boshidan to ohirigacha 1-2
0
C atrofida olib borilsa intakt, ya’ni 
ATF sintezlash qobiliyatini saqlagan mitoxondriyalar ajratib olinadi. Sentrifuga 
rotoridagi harorat 1-2
0
C atrofida bo’lishi kerak. Yaxshilab aralashtirilgan 
mitoxondriyalarni nafas olish va oksidlanishli fosforlanishini aniqlash uchun 2-4
0
C 
haroratda saqlandi. 
Kalamushlarning 
yuragidan 
mitoxondriyalar 
differensial 
sentrifuga 
yordamida [Almatov K.T. va b. 1993 a] ajratilib olindi. 
Dekapitatsiya qilingan hayvonning ko’krak bo’shligi ochilib, yurak qirqib 
olingandan keyin stakanga solindi. Stakanga tarkibi 0,25M saharoza va 10mM tris-
Hcl (pH 7,4)lardan tashkil topgan ajratish muhiti (0-1
0
C atrofida sovutilgan) 
quyildi. Stakandagi yurak qaychi bilan bir nechta bo’laklarga bo’lindi va qondan 
tozalandi. Yurak bo’laklarini bir joyga to’plab, ularning og’irligi tarozida tortiladi 
va 
diametri 
1mm 
li 
mikromaydalagichdan 
bosim 
ostida 
o’tkazildi. 
Mikromaydalagichdan 
o’tgan 
jigar 
molibden 
shishadan 
tayyorlangan 
gomogenizatorga solindi va ustiga 1:10 nisbatda (1g yurak to’qimasiga 10ml) 
sovutilgan ajratish muhitidan quyilib, teflonli ―pestik‖ bilan 50-60 soniya 
davomida gomogenizatsiya qilindi. Gomogenatni polietilendan tayyorlangan 
sentrifuga probirkalariga solindi. Birinchi probirkaga normal kalamushlarning 
yurak gomogenati ikkinchi probirkaga oddiy suv solindi. Probirkalar tarozida 
tortilib bir xil og’irlikka keltirildi va sentrifugani (TSLR-1) uyachalariga qarama-
qarshi holatda joylashtirildi. Sentrifuga rotori 10 daqiqa davomida (bir daqiqada 
1700-1800 aylanish tezligida) 600g tezlikda aylantirildi. Natijada gomogenizatsiya 
paytida parchalanmay qolgan hujayralar va yadrolar cho’kmaga tushadi. Cho’kma 

---

38 
ustidagi suyuqlikni (supernatantni) toza probirkaga quyilib yana tarozida tortildi va 
ikkala probirkalar bir xil og’irlikka keltirildi. (Probirkalarni og’irligini tenglashda 
ajratish muhitidan foydalanildi). 
Probirkalar sentrifuga rotoridagi uyachalariga qarama-qarshi holatda 
joylashtirilib 30 daqiqa davomida 6000g tezlikda (1 daqiqada 5500-6000 aylanish 
tezligida) sentrifuga qilindi. Bunda og’ir va o’rtacha og’irlikdagi mitoxondriyalar 
cho’kmaga tushadi. 
Supernatantda esa yengil mitoxondriyalar va mikrosomalar qoladi. Supertant 
to’kib tashlandi va cho’kma ustiga pipetkada 2-3 ml ajratish muhiti probirka 
devoriga tekizilib ohistalik bilan quyiladi (cho’kmadagi mitoxondriya chayqalib 
ketmasligi uchun) va asta-sekinlik bilan quyilgan suyuqlik to’kib tashlandi. Buning 
natijasida probirka devorlarida yopishib qolgan mikrosoma va yengil 
mitoxondriyalar, hamda to’qimadagi har xil enzimlar yuvilib cho’kmadagi 
mitoxondriyalar tozalandi. Undan keyin, yana probirkaga 1-2ml ajratish muhiti 
solinib avvaldan sovutilib qo’yilgan shisha tayoqcha bilan cho’kmadagi 
mitoxondriyalar yaxshilab aralashtirilib bir xil holatga keltirildi. Bunda 1ml 
mitoxondriyada 70-80mg oqsil bo’lishiga erishish kerak. Mitoxondriyalarni ajratib 
olish texnologiyasi boshidan to oxirigacha 1-2
0
C atrofida olib borilsa intakt, ya’ni 
ATF sintezlash qobiliyatini saqlagan mitoxondriyalar ajratib olinadi. Sentrifuga 
rotoridagi harorat 1-2
0
C atrofida bo’lishi kerak. Yaxshilab aralashtirilgan 
mitoxondriyalarni nafas olish va oksidlanishli fosforlanishini aniqlash uchun 2-4
0
C 
haroratda saqlandi.