Маъруза мавзуси 8-мавзу: молекуляр клонлаш. Лигирлаш реакцияси. Компонент хужайраларни тайёрлаш ва трансформация қилиш

Маъруза мавзуси


8-мавзу: МОЛЕКУЛЯР КЛОНЛАШ. ЛИГИРЛАШ РЕАКЦИЯСИ. КОМПОНЕНТ ХУЖАЙРАЛАРНИ ТАЙЁРЛАШ ВА ТРАНСФОРМАЦИЯ ҚИЛИШ

РЕЖА
Лигирлаш реакцияси ва уни ўтказиш учун керакли компонентлар. Escherichia coli хужайрасини ўстириш. E. coli компонент хужайраларни тайёрлаш. E. coli хужайрасини генетик трансформациясини ўтказиш. Бактериал колонияларни ПЦР-скрининг қилиш.

ДНК клонлаш (генларни клонлаш) – берилган кетма-кетликдаги ДНКни ажратиш жараёни бўлиб, in vitro да унинг кўпчилик нусхаларини олиш учун ишлатилади. ДНК ни клонлаш кўпинча генларни сақловчи бўлакларни амплификациялаш учун қўлланилади.


ЛИГИРЛАШ РЕАКЦИЯСИ

Лигирлаш реакцияси - бу ДНКнинг икки молекуласини ковалент бирикмасидир. Ушбу реакция учун қуйидаги таркибий қисмлар талаб қилинади: Т4 ДНК- лигаза ферменти, 10Х Т4 ДНК Лигаза буфери, плазмид (вектор) pTZ57R/T ва гелдан ажратилган ПЗР- ДНК фрагменти.

Т4 лигаза - ДНК ферменти - бу молекуляр оғирлиги 55,3 кДа бўлган мономерик полипептид. Фермент ДНКнинг 5`-фосфат ва 3`-гидроксил терминал гуруҳлари ўртасидаги фосфодиэфир алоқасини шаклланишини катализлайди. Ёпишқоқ учларни боғлашдан ташқари, у икки қанотли ДНК парчаларини учлари билан бирлаштириш реакциясини катализациялашга қодир. Т4 фагадан рекомбинант клонланган ДНК лигаза генини олиб юрувчи Escherichia coli штаммидан ажратилган. Оптимал таъсир ҳарорати + 16 ° С. Сақлаш ҳарорати -20 ° С
Буфер 10Х Т4 ДНК - Лигаза лигирлаш реакцияси учун мақбул шароитларни таъминлайди. У қуйидагилардан иборат: 400 мМ Трис-HCI pH 7.8, 100 мМ MgCL2, 100 мМ DTT (дитиотреитол), 5 мМ АТФ. Буферни (- 20 ° С) АТФ парчаланишининг олдини олиш учун, тампонни майда аликотлар ичида, қайта-қайта эримасдан сақлаш керак.
Плазмид (вектор) pTZ57R/T (8.1-расм) ПЗР парчасини Т/А клонлаш ва кейинчалик E. coli бактериал ҳужайраларига айлантириш учун ишлатилади. pTZ57R/T векторининг афзалликлари:

• 
  Бу чизиқли икки қаторли ДНК молекуласи;
  
• 
  Икки занжирнинг 3`-учида дидеокситимидин (ddT) мавжуд бўлиб, бу лигирлаш пайтида векторнинг қайта ишланишига тўсқинлик қилади ва клонлаш маҳсулотларининг юқори маҳсулдорлигини ва ёт маҳсулотларнинг паст даражасини таъминлайди;
  
• 
  Клонлаш самарадорлигини баҳолаш учун кўк-оқ тестдан фойдаланишга имкон беради;
  
• 
  Кўп чекланган эндонуклеазларни таниб олиш жойлари мавжуд, бу эса клонланган парча билан кейинги манипуляцияларни амалга оширишга имкон беради;
  
• 
  М13/pUC праймерини тўлдирувчи нуклеотидлар кетма-кетлигини ўз ичига олади, бу ДНК парчасини секция қилиш ёки ПЗР таҳлилини ўтказиш имконини беради;
  
• 
  T7 промоторликка эга, у киритилган ДНК парчасини in vitro да транскрипция қилишга имкон беради.
  

8.1-расм. PTZ57R/Т векторли харитаси (www.helikon.ru)

Вазифа 5. Лигирлаш реакциясининг баёни.

1. Ишга киришишдан олдин, реакциянинг барча таркибий қисмларини эритиб олинг (8.1-жадвал), Т4 ДНК лигазасидан ташқари, уларни музлатгичга 4 ° С ҳароратда вақтинча сақлаш учун қўйинг.

2. 1,5 мл найчани муз устига қўйинг, 3,7 мкл агарозадан тозаланган ПЗР бўлаги, 0,5 мкл 10Х Т4 ДНК лигаза буферини, 0,5 мкл PTZ57R/Т плазмидни ва 0,3 мкл Т4 ДНК қўшинг. лигазалар, охирги ҳажми 5 мкл.
3. Реакция аралашмасини 1,5 мл найчада хона ҳароратида 1 соат давомида инкубация қилинг.

8.1-жадвал

Лигирлаш реакцияси учун реакция аралашмасининг таркиби