Маъруза мавзуси 8-мавзу: молекуляр клонлаш. Лигирлаш реакцияси. Компонент хужайраларни тайёрлаш ва трансформация қилиш

Реакция таркибий қисмлари
Ҳажм, мкл
Плазмид (вектор) PTZ57R/Т	0,5
ДНК-лигаза буфери T4 10X	0,5
ПЗР-ДНК фрагменти	3,7
ДНК-лигаза Т4	0,3
Якуний реакция ҳажми	5

ESCHERICHIA COLI ҲУЖАЙРАСИНИ ЎСТИРИШ


E. coli штампи XL1-Blue ҳужайраларини ўстириш учун 1 турдаги озиқлантириш воситасидан фойдаланиш мумкин: LB (Луриа-Бертани мухити) ва LB - агарланган (мос равишда 8.2-8.3-жадваллар).
8.2-жадвал
LB (pH 7.5) таркиби

Компенент номи	Миқдор
Триптон	10 г/л
Ҳамиртуруш экстракти, туз сақламаган, тип Д	5 г/л
NaCl 5M	10 г/л
Деионланган сув	1 л

3. 
   жадвал
   

Агарланган LB муҳити таркиби

Компенент номи	Миқдор
Триптон	10 г/л
Ҳамиртуруш экстракти, туз сақламаган, тип Д	5 г/л
NaCl 5M	10 г/л
Агар	5 г/л
Деионланган сув	1 л

E. COLI КОМПЕТЕНТ ХУЖАЙРАСИНИ ТАЙЁРЛАШ ВА ТРАНСФОРМАЦИЯ ҚИЛИШ

Трансформация - уларга ёт ДНКларнинг кириб бориши натижасида ҳужайраларнинг ирсий хусусиятларининг ўзгариши. ДНКни ўзлаштира оладиган ҳужайралар ҳолати компетенция ҳолати дейилади. Одатда, компетентли ҳужайраларнинг максимал сони логаритмик ўсиш фазаси (экспоненционал фаза) охирида кузатилади. Ушбу фаза ҳужайра бўлинишининг доимий максимал даражаси билан ажралиб туради, ҳужайралар ҳажми ва кўплаб бактериялар таркибидаги протеин миқдори ҳам доимий бўлиб қолади.

Компетентлик ҳолатида бактериялар автолизин, эндонуклеаза 1 ва ДНКни боғлайдиган оқсил синтезини фаоллаштирадиган махсус паст молекуляр оғирликдаги протеинни (ваколат омили) ишлаб чиқаради. Автолизин ҳужайра деворини қисман йўқ қилади, бу ДНКнинг у орқали ўтишига имкон беради, шунингдек бактерияларнинг осмотик зарбага чидамлилигини камайтиради (Грант, 1980). Компетентлик ҳолатида метаболизмнинг умумий даражаси ҳам пасаяди. Бактериал конверция учун ДНК икки қаторли бўлиши керак, унинг узунлиги 450 жуфт нуклеотидлардан кам эмас. Жараён учун мақбул pH миқдори 7 га тенг.
E. coli XL-Blue штаммининг тавсифи: Генотип: recА1, gyrА96, thi- 1, hsdR17, suplE44, relAl, lac [F, proAB, lacl^rZAM15, TnlO(Tet^R)]. Идиш: Тетрациклин билан суюлтирилган агарланган LB (концентрацияси 12,5 мг/мл). Суюқ муҳит: LB.
Штамм кўк ва оқ синовларни ўтказишга имкон беради. Рестрикция тизими қисман ишламайди. Плазмид ва фагемидларни етиштириш. F` эпизомига тетрациклин қаршилик гени белгиланади. Шу билан бирга, плазмидни ажратиш учун суюқлик таркибига тетрациклин қўшилмаслиги керак, бу бактериал ҳужайралар девори билан боғлиқ муаммоларни келтириб чиқаради ва центрифуга орқали чўктиришда улар бирлашади.