Маъруза мавзуси 8-мавзу: молекуляр клонлаш. Лигирлаш реакцияси. Компонент хужайраларни тайёрлаш ва трансформация қилиш

Вазифа 1. CaCl₂ усули ёрдамида компетентли E. coli ҳужайраларини тайёрлаш (Cohen et al., 1972).

1. 
   Компетентли ҳужайраларни тайёрлаш учун, 37° C ҳароратда 16-20 соат давомида Петри идишларида ўстирилган, диаметри 2-3 мм бўлган E. coli штампли XL-Blue бактериал колониясини танланг ва уни LB воситаси билан флаконга ўтказинг.
   
2. 
   37° C да 3 соат давомида термостатда инкубация қилинг, шундан кейин 25 мл колба идишдан 2та стерилланган совутилган полипропилен пробиркаларга ўтказинг ва муз устида 10 дақиқа давомида инкубация қилинг.
   
3. 
   Кейинчалик, пробиркадагини 10 минут давомида 4°C да, 6 минг айланмада центрифуга қилинг, сўнгра суюқликни чўкган остки қисмини эҳтиёткорлик билан чиқинди стаканга тўкиб ташланг ва уни ағдармасдан фильтр қоғозига пробиркани қолдиқ суюқликни йўқотиш учун тепадан пастга қаратиб жойлаштиринг.
   
4. 
   Ҳар бир пробиркада таркибида 10 мМ MgCh ва 5 мМ CaCl2 ни ўз ичига олган тайёрланган ва совутилган 15 мл эритма билан ресуспензия қилинг.
   
5. 
   Олинган аралашмани 10 минут давомида 4°C да, 6000 айланада центрифуга қилинг, сўнг суюқликни остки қисмини олиб ташланг, ҳар бир пробиркадаги қолдиқни миқдорини олдиндан тайёрланган ва совутилган 0,1 М CaCh эритмасидан 2 мл солиб ресуспензия қилинг.
   

Вазифа 2. E. coli ҳужайраларининг генетик трансформациясини ўтказиш

1. 
   Ҳар бир 1,5 мл центрифуга пробиркаларига 5 дақиқа давомида олдиндан совутилган пробиркалардан 200 мкл компенентли ҳужайра эритмасидан қўшилади ҳамда олдинги босқичларда олинган 2 мкл лигацион аралашмани қўшилади.
   
2. 
   Лигирлаш реакцияси маҳсулотлари билан аралаштирилган компенентли ҳужайралар эритмасини 30 дақиқа давомида музда сақланади, кейин сув ҳаммомида 42°C ҳароратда 90 секундгача қиздирилади, сўнг пробиркадаги транформация қилинган ҳужайраларни тезда музга қайта ўтказилади.
   
3. 
   Кейин 800 мкл LB муҳитини қўшилади ва 37°С 1 соат давомида шайкерда инкубация қилинади.
   
4. 
   Инкубациядан сўнг бактерияларни таркибида ампициллин (100 мг/мл концентрацияда), тетрациклинни (12,5 мг/мл концентрациясида), 40 мкл 100 мМ IPTG ва 40 мкл 1 мМ Х-ГАЛ бўлган селектив муҳитга экинг.
   
5. 
   Идишларни 37° C ҳароратда 14-16 соат давомида инкубация қилинг.