Lipoproteínas plasmáticas

TRABAJO PRÁCTICO: Análisis de lipoproteínas plasmáticas
Las lipoproteínas plasmáticas son macromoléculas complejas, compuestas de una mezcla heterogénea de proteínas (apoproteínas) y lípidos, estabilizada por fuerzas no covalentes, cuya principal función es la solubilización y el transporte de los lípidos en el plasma. También intervienen en el mantenimiento de la composición lipídica normal de las membranas celulares, por intercambio y transferencia de lípidos. Son partículas esféricas con un centro apolar de triglicéridos y ésteres de colesterol, rodeado por moléculas polares como fosfolípidos, colesterol y apoproteínas.

Las principales lipoproteínas del plasma se clasifican en cuatro grandes grupos que pueden ser separados por ultracentrifugación o electroforesis.

Según su densidad se separan por ultracentrifugación en:

Lipoproteinas	Densidad (g/ml)	Diámetro (A)
Quilomicrones	0.95	750-6000
VLDL (lip. de muy baja densidad)	0.95-1.006	280-750
LDL (lip. de baja densidad)	1.006-1.063	210-250
HDL ( lip. de alta densidad)	1.063-1.210	50-120

Como se puede observar, la densidad de las lipoproteínas está relacionada de manera inversa a su tamaño.

Mediante la electroforesis del suero en geles de agarosa, se pueden diferenciar, por tinción para lípidos, 4 bandas: una que queda en el origen y corresponde a los quilomicrones (ausentes en el suero normal de individuos en ayuno de 12 hs.); otra que migra como las -globulinas y que contiene a las LDL; una tercera llamada pre-lipoproteína que contiene a las VLDL y una cuarta banda que migra como las -globulinas y que contiene a las HDL.

Origen LDL VLDL HDL

Esquema electroforético de un suero normal luego de ayuno

Se debe aclarar que en geles de agarosa las partículas migran principalmente según sus cargas, debido al gran tamaño de sus poros.

Otra metodología disponible para la separación de las lipoproteínas consiste en una cromatografía en columna de “Superose 6”, la cual está compuesta de una matriz basada en agarosa (Límite de exclusión: 4x10⁷ Da. Rango de separación óptima: 5 kDa- 5x10⁶ Da). En estas condiciones la separación de las partículas se basa en la diferencia de tamaño de las mismas (filtración molecular) y se utiliza un equipo de cromatografía en mediana presión (FPLC).


Esquema del perfil de elusión de una columna de superosa 6

Las distintas lipoproteínas plasmáticas difieren en la proporción de lípidos y en el tipo de apoproteínas que contienen.

Quilomicrones VLDL LDL HDL

(%) (%) (%) (%)

Apoproteínas 2 7 21 47

Colesterol 7 20 47 18

Triglicéridos 85 55 9 7

Fosfolípidos 6 18 23 28

Composición de las diferentes lipoproteínas

Parte experimental
Parte I: Efecto de la inyección de estrógeno sobre las lipoproteínas plasmáticas de pollo
Antecedentes

En la gallina ponedora, para que se forme el huevo, los estrógenos inducen la producción hepática de una lipoproteína particular propia del pollo llamada VLDLy (dirigida a la yema) en lugar de la VLDL genérica que hemos estudiado.

Estas VLDLy son partículas ricas en triglicéridos, contienen apolipoproteína B100, están reducidas a la mitad en tamaño respecto de la VLDL genérica, son resistentes a la lipoprotein-lipasa y son captadas intactas por los receptores de los oocitos. La yema de huevo es rica en triglicéridos transportados desde el hígado hasta el oocito en las VLDLy (revisado en Walzem y col., 1999).

Las gallinas, luego de alcanzar la madurez sexual, desarrollan espontáneamente hipertrigliceridemia endógena, un fenómeno que puede ser inducido experimentalmente en pollos inmaduros por la administración de estrógenos.

Kudzma y col. (1975) y Dashti y col. (1983) han descripto que la administración de estrógenos a gallinas sexualmente inmaduras produce un aumento de hasta 200 veces en la concentración de lipoproteínas de muy baja densidad, de unas 35 veces en las de baja densidad y una marcada reducción en las de alta densidad.

La composición de las apoproteínas se altera marcadamente con predominio de una proteína de aproximadamente 14.000 (apo VLDL II o apo V-II) en todas las fracciones lipoproteicas. La expresión de los genes de estas apo V-II es regulada por estrógenos.

Estas observaciones indican que la administración de estrógenos induce hiperlipidemia y ateroesclerosis acompañada por marcadas alteraciones, tanto cuali como cuantitativas (en su composición y tamaño), en las lipoproteínas plasmáticas.

Todo esto se traduce en un incremento en la concentración plasmática de triglicéridos (por una mayor producción de triglicéridos hepáticos), y un aumento del colesterol plasmático (aunque en menor proporción que el de los triglicéridos), formándose lipoproteínas con un gradiente continuo de densidad (0,95 < δ < 1,063).

En este práctico se estudiará el efecto de la administración de un estrógeno sintético, el dietilestilbestrol (DES), sobre las lipoproteínas plasmáticas de pollo.

El material de trabajo de este laboratorio serán muestras de suero de diferentes animales, por lo tanto deben tener precaución de no tomar contacto con las muestras. El manipuleo de los sueros se realizará utilizando micropipetas automáticas. NO PIPETEAR CON LAS BOCA LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS.

Animales de experimentación:

Se utilizan pollos inmaduros (600 g de peso), machos, alimentados con una dieta estándar. Los tratados con estrógeno reciben subcutáneamente 24 mg y 12 mg de DES (disueltos en aceite de maíz) 48 hs y 24 hs respectivamente, antes de la extracción de sangre. Animales controles se inyectan con aceite de maíz sin estrógeno.

Se realizarán determinaciones de colesterol y triglicéridos séricos y también se fraccionará las lipoproteínas del suero de pollos control y tratados en soporte de agarosa. Se analizarán los resultados obtenidos.

Parte II: Efecto de la administración de una dieta rica en colesterol sobre las lipoproteínas plasmáticas de conejo.
Antecedentes

Los conejos que reciben una dieta rica en colesterol presentan un marcado incremento en los valores del colesterol total, mientras que los niveles de triglicéridos se mantienen normales. En el caso de las liproteínas, se observa un incremento de las LDL y un llamativo aumento de las HDL.

Animales de experimentación

Se utilizan conejos machos (850 a 1000 g de peso) alimentados durante 5-6 semanas con alimento balanceado + colesterol (animales tratados). Animales controles solo reciben alimento balanceado. Luego se toma una muestra de sangre de la oreja previo ayuno de 12 horas, con heparina como anticoagulante. Se centrifuga a 5.000 rpm durante 10 minutos y se separa el plasma.

La dieta de los conejos tratados se prepara de la siguiente manera: se hidrata el alimento balanceado y se mezcla con colesterol puro al 1% usando almidón como ligante (vol: 10%). A esta pasta se la amasa y se forman croquetas de igual forma y tamaño y se deshidratan en horno a 100°C.

Se realizarán determinaciones de colesterol y triglicéridos y el fraccionamiento de lipoproteínas en soporte de agarosa. Se analizarán los resultados obtenidos

Determinación del colesterol sérico

Fundamento del método: el colesterol es oxidado enzimáticamente por la colesterol oxidasa, previa hidrólisis enzimática de los ésteres mediante una lipasa (colesterol esterasa). El agua oxigenada generada en la oxidación, produce la copulación oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona, catalizada por la peroxidasa, con formación de una quinoneimina, de acuerdo al siguiente esquema de reacción:

lipasa

colesterol esterificado colesterol + ácidos grasos

colesterol oxidasa

colesterol + O₂ colesten-3-ona + H₂O₂

peroxidasa

2H₂O₂ + fenol + 4-aminofenazona quinoneimina + 4 H₂O

(color rosado)

Reactivos

Solución standard: solución acuosa de colesterol 2 g/l. Mezclar por inversión antes de usar.

Reactivo de trabajo: En probeta, agregar respetando el orden,

- 4 ml de solución de 4-aminofenazona 37 mM (Cromógeno1).

- 4 ml de solución de fenol 66 mM en buffer (Cromógeno 2).

Llevar a 50 ml con agua destilada y por último agregar:

- 0,4 ml de suspensión de Enzimas 3 (previamente homogeneizada):

lipasa  6000 U / ml. 

colesterol oxidasa  60 U / ml.

peroxidasa  400 U / ml.  

Mezclar por inversión antes de usar. Evitar la formación de espuma. Estable a 4C por 60 días. Proteger de la luz.
Procedimiento

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Blanco Standard Control Tratado

Standard ---- 10 l ---- ----

Suero de pollo o conejo ---- ---- 10 l 10 l

Reactivo de trabajo 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Mezclar. Incubar 5 minutos en baño de agua a 37^oC. Retirar, enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm, llevando el aparato a cero con el blanco. El color es estable 60 minutos.

Determinación de triglicéridos séricos

Fundamento del método: el esquema de reacción es el siguiente:

triglicéridos lipoprotein lipasa glicerol + ácidos grasos

glicerol + ATP glicerolkinasa glicerol-3-P + ADP

glicerol-3-P + O₂ glicerol fosfato oxidasa H₂O₂ + dihidroxiacetonafosfato

2 H₂O₂ + 4-aminofenazona + 2,4 diclorofenol peroxidasa quinoneimina + 4H₂0

(color rosado)

Reactivos

Solución standard: solución de glicerol 2 g/l. Lista para usar.

Cromógeno 1: 4-aminofenazona 0.25 mM

Cromógeno 2: clorofenol 0.60 mM en buffer

Enzimas 3: Vial de polvo seco, para una concentración de enzimas y cofactores de:

lipoprotein lipasa > 12 KU/l

glicerol kinasa > 1 KU/l

glicerol fosfato oxidasa > 4KU/l

peroxidasa 2 KU/l

ATP > 0.8 mM

Reactivo de trabajo: En el frasco de Enzimas 3 agregar:

-10 ml de Cromógeno 1

-10 ml de Cromógeno 2

Mezclar suavemente. Esperar 15 minutos antes de usar. La mezcla es estable a 4°C por 30 días. Proteger de la luz.

El reactivo de trabajo puede presentar una coloración rosada, sin que ésto signifique deterioro.

Procedimiento

Homogeneizar la muestra antes de usar, especialmente si se trata de sueros lechosos. En cuatro tubos marcados B (blanco), S (standard), C (control) y T (tratado) colocar:

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Blanco Standard Control Tratado

Standard ---- 10 l ---- ----

Suero de pollo o conejo ---- ---- 10 l 10 l

Reactivo de trabajo 1ml 1ml 1ml 1ml

Mezclar. Incubar 5 minutos a 37^oC o 20 minutos a temperatura ambiente. Enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm. El color obtenido es estable 60 minutos. La hiperlipemia puede causar turbidez en el ensayo. En tal caso procesar una dilución de la muestra.
Fraccionamiento de lipoproteínas plasmáticas en soporte de agarosa. (Noble, R. P. (1968) J. Lipid Res. 9, 693-700)

Materiales

Buffer Tris-Glicina 0,4 M pH 8,3: 14,1 gr Tris + 22,6 gr glicina, llevar a 1000 ml.

Solución de agarosa 0,6%: dejar hidratar 0,6 gr de agarosa en 100 ml de buffer Tris-Glicina unos 10 min. y luego calentar hasta disolución total a baño maría. Fraccionar en tubos y guardar en la heladera a 4C. La solución se conserva aproximadamente 30 días.

Solución fijadora: 67 ml etanol + 1,5 ml metanol +1,5 ml isopropanol + 30 ml agua. Duración 30 días.

Solución colorante: disolver 2 gr de acetato de zinc en 40 ml de agua y agregar 0,2 gr de Sudan Black disueltos en 60 ml de etanol. Mezclar y filtrar. Guardar en frasco color caramelo. Duración 30 días. Esta solución colorea la fracción lipídica de las lipoproteínas.

Muestra: suero o plasma con EDTA al 5% como anticoagulante.
Procedimiento

Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado depositar y distribuir 1,8 ml de agarosa fundida a baño maría. La agarosa debe tener una temperatura de aproximadamente 60-70ºC. CUIDADO DE NO QUEMARSE SI LA TEMPERATURA DEL FRASCO ES SUPERIOR LUEGO DEL FUNDIDO DE LA MUESTRA. Colocar inmediatamente (a 2 cm del borde) un dispositivo para formar el canal de siembra. Esperar 5 a 10 min. Retirar el dispositivo y sembrar en el canal 10 l de suero mezclados con azul de bromo fenol para visualizar el frente de corrida.

Colocar el portaobjetos en la cuba electroforética y conectar sus bordes con el buffer mediante papeles de filtro humedecidos. Encender la fuente de poder y aplicar 2,5 mA de corriente por portaobjetos. UNA VEZ ENCENDIDA LA FUENTE NO TOCAR LA CUBA NI LOS DSIPOSITIVOS DE CORRIDA DEPOSITADOS EN ELLA MIENTRAS HAYA PASO DE CORRIENTE POR EL SISTEMA. Detener la corrida cuando el azul de bromo fenol haya recorrido 4 a 5 cm







<sub>gel de agarosa

papel

papel</sub> ^{canal de siembra}



_{buffer buffer}




Esquema de la cuba electroforética
Luego de apagar la fuente de poder, retirar los portaobjetos de la cuba y sumergirlos en la solución fijadora durante por lo menos 30 min. Retirar con cuidado y colocarlo en una cámara húmeda. Llevar a estufa a 70C (esta operación tiene por finalidad desecar completamente el gel de agarosa, el cual se transforma en una fina película adherida al portaobjetos). Sumergir el portaobjetos en la solución colorante durante 15 a 30 min, controlando el desarrollo del color, lavarlo con agua y dejarlo secar al aire. Hacer las observaciones correspondientes.
Referencias

Dashti N., Kelley J. L., Thayer R. H., Ontko J. A. (1983) Concurrent inductions of avian hepatic lipogenesis, plasma lipids, and plasma apolipoprotein B by estrogen. J. Lipid Res. 24:368-380.

Kudzma D. J., St. Claire F., DeLallo L., Friedberg S. J. (1975) Mechanism of avian estrogen-induced hypertriglyceridemiaevidence for overproduction of triglyceride. J. Lipid Res. 16:123-133.

Noble, R. P. (1968) Electrophoretic separation of plasma lipoproteins in agarose gel. J. Lipid Res. 9:693-700.

Walzem RL, Hansen RJ, Williams DL, Hamilton RL. (1999) Estrogen induction of VLDLy assembly in egg-laying hens. J. Nutr. 129:467S-472S.

Informes de Resultados

1. 
   Indique los valores obtenidos en los siguientes tratamientos
   

		Control	Tratado
Pollo	Colesterol
	TAG
Conejo	Colesterol
	TAG

1. 
   ¿Qué diferencias observa entre los valores de colesterol y de TAG obtenidos para cada animal (control y tratado)?
   

2. 
   Compare las variaciones observadas en los valores de colesterol y TAG entre los animales tratados
   

2. 
   Grafique los perfiles de lipoproteínas. Complete los polos y dirección de migración e indique a que lipoproteína corresponde cada banda.
   

Suero de pollo control



Suero de pollo tratado



Suero de conejo control



Suero de conejo tratado