Лаборатория мавзулари 1, 2, Вирусларни юқтириш усуллари

18- 19-лаборатория иши
TMBнинг дифференциал центрифугалаш методи билан
тоза препаратини олиш


Ишдан мақсад. Ҳар хил тезликда моддаларни чўкмага тушганига асосланиб вирусларни тозалаш усули билан такомиллаштириш.
Керакли материаллар. Препаратив ультрацентрифуга ва унинг роторлари, пробиркалари, шприц ва вирус тозалашнинг бошқа методларида ишлатилган материаллар.
Ишнинг бориши. Центрифуганинг яхшилаб ювилиб куритилган пробиркаларига вирусли эритма (8-машгулотдаги "намуна тайёрлаш" бўлимига қаралсин) центрифуга қопқоғидаги қараш тешикчасигача қуйилади, сўнгра пробиркалар тарози ёрдамида тенглаштирилади ва қопкоклар аввал қўл билан, сўнгра махсус "калит —мослама" билан ёпилади. Пробиркаларнинг тенглиги қайта торозида текширилади, сўнгра бурама қопқоқлари билан герметик .ёпилади (агар пробиркаларнинг бири оғирроқ бўлса, баробарлаштириш учун шприц ёрдамида эритмадан қўшилади).
Пробиркалар центрифугани роторига бир-бирига карама-қарши қилиб қўйилади. Ротор зич қилиб қопқоқ билан ёпилади ва ультрацентрифуга камерасига жойлашти — ри Л.1ДМ (ультрацентрифуга роторини ўрнатиш ва центрифугани ишлатиш оператор томонидан бажарилади) Центрифугалаш 90 минут давомида 105 000 g да центрифугаланади.
Ультрацентрифуга тўхтагандан сўнг, ротордан пробиркаларни чиқариб олинади, пробирканинг энг тагида озгина жигар ранг вирус чўкмаси ва чўкма усти суюқлиги кузатилади. Чўкма усти суюқлигини тўкиб ташланади, вирус чўкмасини эса озгина 0,01 M трис —HCl буферида (pH —7,6) эритилади. Агар вирус яхши тозаланган бўлса оқ—ҳаворанг "опалесценция" кузатилади. Эритмани 15—18 минг айл. Налигида центрифугаланади ва эримаган қисмидан ажратилди. Эримаган чўкмани яна бир марта 1—2 мл буфер Видан зритиб, чўктириб, чўкмаусти суюклигини асосий ви­рус эритмасига қўшилади ва сақланади.
Шу дифференциал центрифугалаш циклини 3—4 марта кайтариб етарлича тозаланган вирус препарата олинади.
Вирусларнинг ўлчамлари (10 — 600 нм) ва зичликлари Шундайки, агар уларга марказдан қочма кучини 30000 дан 20000 gа тасир эттирилса, вирус зарралари чўкмага тушади. Шy мақсадда препаратив ультрацешрифуталарнинг роторларини минутига 50000 — 60000 марта айлаиадиган центрм фугалари ишлатилади. Энг машҳурларидан HitachiMS Е фирмасининг SpincoL 2 ва SpincoL 50, Super—25SpeedSuper — Speed — 40, Super—Speed —50, ГДР нинг Vac-40Vac — 60 центрифугалари ишлатилади. Улар ротор тўпламларига эга. 1500 мл суюқликни 59000 да айлантирадиган poторлардан 80—100 мл суюқликни 200000 gгача айлантирадига роторларга эга.
Дифференциал центрифуга усулида вирус тозалаган вирусни суспензиядан чўктирилади, бошқатдан суспензий ҳолатига ўтказилади, совуқда магнит айлантиргичида чайқатилади ҳамда паст тезликда центрифугаланади (6000 г 30 мин). Бу жараённи бир неча марта қайтариш мумкин.
Ҳайвон вирусларини, бактериофагларни бир цикл дифференциал центрифугалаш билан тозалаш қийин бўладн, Бунда аввал ҳар хил усулларда (м., ионалмашиш хроматографияси) вирус тозалаш босқичларидан ўтиб, вирусни кагм ҳажмли суюқликдан кичик ҳажмга ўтказишда ишлатилицЯ мумкин. Усимлик вирусларини тозалашда бу метод яхшисамара беради.