Лаборатория мавзулари 1, 2, Вирусларни юқтириш усуллари

12- лаборатория иши
Вирусларни изоэлектрик нуқтада чўкишини аниқлаш
Ишдан мақсад. Вирусни тезкорлик билан рН ўзгаришига асосланиб қисман тозаланган препаратини олиш билан таништириш.
Керакли материаллар. ТМВ билан касалланган тамаки барги (500 г) 0,1 М фосфат буфери, рН 7,0-7,5 2. 0,1М, 1М НС1, 1М Na ОН, рН- метр, N. glutinosa,эксикатор,хлороформ ҳамда вирус экстракциясида ишлатиладиган асбоб —ускуна ва идишлар.
Ишнинг бориши. Тамаки мозаикаси вируси билан касалланган ўсимлик ширасини юқорида айтилган усуллардд ажратиб олинади ва уни хлороформ ёки бутанол ёрдамидд яна ишлов бериб, центрифуга ёрдамида тиниқлаштирилиб, вирусли экстракт ажратиб олинади. Сўнгра унга 1М НС1 дан қўшиб доимо аралаштириб турилади. рН ни 5,0 — 5,5 га келгунча индикатор қоғоз билан текшириб борилади. Энди 0,1 н НС1 ёрдамида рН 4,5 га туширилади, бу боскичда рН-метрдан фойдаланилади. рН 4,4 — 5,5 орасида охисталик билан кислота томизиш маъқул, акс холда вирусли экстрактнинг махаллий участкасида рН кескин пасаяди ва балласт оқсиллар билан бирга вирус ҳам изоэлектр ҳолатга келиб чўкиши мумкин. рН 4,5 ra тенг бўлганда суспензиядан чўкмага ўтадиган хужайра балластларини 3 -5 минг айл/ тезлигида центрифуга ёрдамида 3- 5 минг айланиш тезлигида 20 минут айлантириб ташланади. Чўкма усти суюқлигини 0,1Н НС1 билан рН 3,5 гача нордонлаштирилади. Бу рН да ТМВ зарралари изоэлектрик ҳолатга ўтади, агрегатлар пайдо бўлади ва аралаштирилганда сезиладиган даражада игнасимон паракристаллар ҳосил бўлади. Натижада эритма ипаксимон ялтирайди. Эритмани совуқхонада тўлиқ кристалланиши учун кечасига қолдирилади. Эртасига вирусли экстракт солинган стаканга ташқаридан назар солинса, унинг тубида вирусли чўкма яққол кўзга ташланади. Вирусли чўкмани 6000 айланиш тезлигида 20 минут давомида центрифугалаш билан ажратилади. Чўкмани 0,01 М фосфат буферида эритилади. Эритиш учун ишлатиладиган буфернинг миқдори энг биринчи вирусли материални экстракция қилиш учун ишлатилган буферни 1/10 миқдорини ташкил қилади. Демак, вирус 10 марта қуюқлашади.Вирусли эритмани 0,1 NaOH билан рН 7,0-7,5 гача кўтарилади (рН индикатор қоғоз ёрдамида назорат қилиб борилади). Сўнгра эритма 15-18 минг айланиш тезлигида 10 минут давомида центрифуга қилиниб, эримаган чўкма узоқлаштирилади. Сўнгра вирусни иккинчи марта қайтадан чўктирилади. Вирусли суспензияни 0,1 н НС1 билан эҳтиёткорлик билан муттасил аралаштирилган ҳолда рН 3,5 гача нордонлашти­рилади (рН диққат билан рН-метрда назорат килиб борилади. Вирусли экстрактни тўлиқ кристалланиши учун музлатгичда ёки музли ҳаммомда 1 соатга қолдирилади. Чукма минутига 6000 айланиш тезлигида 20 минут давомида центрифута қилинади.Тиниқ чўкмаусти суюқлигини ташлаб юборилади, чукмадаги вирус кристаллари 15- 20 мл 0,01М фосфат буферида (рН 7.5) эритилади. Суспензия эҳтиёткорлик билан рН 7 5 гача ишқорийлаштирилади. Сўнгра минутига 15- 18 минг айланиш тезлигида 10 минут давомида центрифуга қилинади. Чўкма 5-6 мл 0,1 М фосфат буфери билан ювиб ташланади ва центрифуга қилинади. Ювинди сувлар одатда асосий вирусли эритма билан бирлаштирилади. Юқоридаги усуллар билан тозаланган вирус бошқа методлар билан охиригача тозаланади. Катта ҳажмдаги (бир неча литр) вирусли эритмани и.э.н да чўктирилганда, чўкма усти суюклигини чўкмадан сифон ёрдамида ажратиш мумкин.