Лаборатория мавзулари 1, 2, Вирусларни юқтириш усуллари

13- лаборатория иши
Вирусларни қисман тозаланган препаратини олиш
Ишдан мақсад. Юқори ион кучига чидамли вирусларни аммоний сульфати ёрдамида қисман тозалаш методи билан таништириш.
Керакли материаллар. ТМВ билан касалланган тамаки барги (500 г); 0,1М фосфат буфери, рН 7,0-7.5; 0,1 н НС1; 0,1 н NaOH;. ЭДТА; аммоний сульфат; хлороформ; вирус экстракциягида ишлатиладиган асбоб- ускуна ва идишлар.
Ишнинг бориши: Вирус билан касалланган ўсимлик барги 1:1 нисбатдаги 0,1М ФБ (рН 7,5) билан гомогенизация қилиниб, хлороформ билан ишлов берилиб тозаланган вирус экстрактига 20% аммоний сульфати солиниб яхшилаб аралаштирилади. Сўнгра 30 минут давомида совутгичда тутилади, чўкмага талайгина балласт моддалар тушади. Уларни минутига 3минг айл/тезлигида 20 минут давомида центрифуга қилинади.Чуўкма усти суюқлигига 25% гача аммоний сульфат солинади ва яхшилаб аралаштирилади ва яна 60 минут кристаллар ҳосил бўлиши учун сақланади. Инкубация вақтида вирус паракристаллари ҳосил бўлиши жараёнида ипаксимон ялтираш пайдо бўлади.
Вирусли идиш вирус тўлиқ кристалланиши ва чўкиши учун кечасига совутгичда қолдирилиб кетилади. Эртасига сифон ёрдамида чўкма усти суюқлиги ажратилади. Қолган чўкмадаги вирусли суспензия минутига 6 - 8 минг айланиш тезлигида 15- 20 минут центрифуга қилинади ва чўкма 100мл 0,01М фосфат буферига, рН 7,5 (0,005М ЭДТА солинган эритувчида) эритилади. Сўнгра тозалашнинг кейинги боскичида диализ қилинади. Бу жараёнда вирусли суспензия таркибидаги ионлар йўқотилади, ҳамда ўсимликни кўпгина моддалари денатурацияланиб эримайдиган ҳолатга ўтади.
Диализ қопчасига вирусли суспензияни солингандан сўнг уни 3- 5 литрли сув ёки буфер эритмаси тўлатилган идишга тушириб қўйилади. Сувли идиш магнитли айлантиргичга ўрнатилади. Диализ 24 соат давомида олиб борилиб, шу даврда 3 марта диализ суви (буфер) алмаширилади. Диализ тугагандан сўнг препарат 10 минут 15-18 минг айл/тезлигида центрифуга қилинади. Чўкма ташлаб юборилади. Вирусли эритмани (чўкмаусти суюқлиги) қайтадан 25% ли сульфат аммоний билан чўктирилади ва 20-30 минутдан сўнг 20 минут давомида 6минг айл/тезлигида центрифуга қилинади. Чўкмаусти суюқлиги ташлаб юборилади, чўкмали стакан эса тоза фильтр қоғози устига (тузли эритма оқиб тушиши учун) тўнтариб қўйилади. Сўнгра чўкмани 20 мл 0,01М фосфат буферида (рН 7,0- 7,5) эритилади ва 15-18 минг айланиш тезлигида центрифуга қилиниб, эримаган қисмидан ажратиб ташланади.
Шу усулда ажратиб олинган қисман тозаланган препарат энди бошқа усуллар билан тўлик тозаланиши мумкин.