Kichik plazmidalar, bakteriofaglar va kasmidalardan yot genlarni klonlashda vektor sifatida foydalanish

Odam birinchi xromosomasming genetik xaritasi­
2-jadval

Gen timsol	Marker	Polimorfizm	Qismi	Muqarrarligi
A12M1	19-adenovirusning joylashish 1S uchastkasi		q42q43	B
A12M2	12-adenovirusning joylashish IA uchasthasi		P36	B
A12M3	12-adenovirusning joylashish 1B uchastkasi		21	B
AK2	2 - Adenilatkinaza		P ter32	D
AMY1	a- Amilaza so lak bezlar)		p22.1q11	D
AMY2	a Amilaza (pan rat k)	+	p22.1q11	D
AT3	III Antitrombin		q23q25	B
CAE	Ko'z gavharining pereferik qavatlarining xiralashishi			D
DIS1	DNK fragmenti		p36	B
DIZ1	3 - Satellit DNKsi		q12	B
Do	Dombrok qon guruhi	+		G
ELI	Eliptotsitoz (Rh bilan birikkan)		p	G
EL2	Eliptotsitoz (Rh bilan birikmagan)			G
ENO1	1- Yenolaza		P36	D
FH	Fumaratgidrataza		q42qter	D
FUCA	a-L - Fukozidaza	+	p34p32	D
Fy	Daffi qon guruhi	+	Pterq21 yoki q32---> qter	D
GALE	UDPGAL 4 - Epimeraza		pterp32	D
GBA	Nordon (3- glyukozidaza		Pllqter	B
GDH	Glyukozodegidrogenaza	+	pterp21	D
GUK1	1- Guanilatkinaza		q32 q42	D
GUK2	2 - Guanilatkinaza			D
MTR	Tetragidropteroilglutamat- metilteransferaza			B
PEPC	S Peptidaza	+	q25 yoki q42	D
PEKM	Fosfofruktokinaza M subbirligi		p.32.1q32	B
PGD	Fosfoglyukonatdegidrogeneza	+	Pterp34	D
PGM1	1- Fosfoglyukomutaza	+	P22.1	D
PKU1	Fenilketonuriya			P
Rd	Radin qon guruhi		p34p22.1	B
Rh	Rezus qon guruhi	+	p364p32	D
RN5S	55 RNK		q42q43
RP1	Retinit			G
Sc	Ssianna qon guruhi	+	p34p32	D
SDH	Suksin atdegidrogeneza		p22.1qter	B
UGP1	UPD-glyukozopirofosfatazal		q21q22	D
UMPK	Uridinmonofosfatkinaza	+	p32	D

Genlar xaritasidagi ayrim gen xillari esa molekulalarning testlarida qatnashuvchilar hisoblanadi. Genetik xaritada faqat genlargina emas, balki ularning ko`pchiligining DNKdagi izchil­ligi ham ko'rsatilgan. Olib borilgan genetik tadqiqotlar nati­jasida genlar polimorfizmi ma'lum bo`ldi. Qayd etilgan gen­larning ayrimlarini testlash va ular orqali odamlar oilasini ge­netik tahlil qilish imkoniyati tug'ildi. Genetik injeneriya taraq­qiyoti bilan hozirgi paytda odamning to'liq genetik xaritasini tuzishda birorta ham texnik to'siq yo'q. Biroq odam DNK ko'lamining nihoyatda kattaligi tufayli bunday tadqiqot uchun ko'p yillar zarur bo'ladi.

Irsiyatning xromosoma nazariyasi. 1902-1903 yillarda amerikalik tadqiqotchi Setton va germaniyalik Boveri bir­biridan mustasno irsiy omillar (genlar) xromosomalarda joy­lashgan bo'lishi mumkin, deb taxmin qildilar. Bu g'oya ir­siyatning xromosoma nazariyasini yaratishni boshlab ber­di. «Gen» iborasi 1909 yil daniyalik olim Iogannsen to­monidan ilgari surilgan. Hujayra bo'linayotganda genlar bilan xromosomalar xatti-harakatida va gametalar hosil bo'lishida uyg'unlik borligi haqidagi g'oya ham genlar xro­mosomalarda joylashganligidan dalolat beradi. 1910 yili T.Morgan o'z shogirdlari bilan drozofila meva pashshasida belgilarning irsiylanishiga oid tajriba yakunlarini tahlil qilish orqali gen bilan xromosomalar orasida bog'lanish borligini isbotladilar hamda irsiyatning xromosoma nazariyasini tajribada asosladilar. 1913 yili Bridjes jinsiy xromosomalar tarqalmaganda jins bilan bog`liq holda belgilarning irsiylanishini o'rganishiga asos­lanib irsiyatning xromosoma n azariyasini yan a bir marotaba isbotlab berdi.
Shunday qilib, yuqorida qayd etilgan olimlarning tadqiqot­lari tufayli irsiyatning xromosoma n azariyasi yaratildi.
Irsiyatning xromosoma nazariyasining asosiy qoidalari quyidagilar:
1. Genlar xromosomalarda va ma'lum izchillikda joylashgan.
2. Genlar irsiy jihatdan bir butun va nisbatan turg'un.
3. Bir xromosomada joylashgan genlar birikkan holda irsiy­lanadi va birikish guruhini hosil etadi.
4. Genlarning birikish guruhi xromosomalarning gaploid
to'plamiga to'g'ri keladi.
5. Genlar birikishi bilan aloqador belgilar odatda avloddan­avlodga birgalikda irsiylanadi.
6. Genlarning birikishi krossingover jarayonida buzilishi mumkin. Natijada rekombinat xromosomalar hosil bo`ladi.
7. Xromosomalardagi genlar bir-biridan qanchalik uzoq joy­lashgan bo'lsa, ular orasidagi krossingover foizi shunchalik kat­ta bo'ladi.
8. Genlarning birikishi va krossingover hodisasi xromosoma­larda genlar xaritasini tuzish imkonini beradi.
Molekulyar biologiya fanining hozirgi taraqqiyoti zamini­da prokariot va eukariot organizmlarning xromosoma n a­zariyasini yanada rivojlantirish imkoni tug'ildi. Yaqin vaqt­ga qadar genlar irsiyatning bo'linmas birligi deb qaralgan bo'lsa, endilikda genlarning nozik tuzilishi va faoliyati aniq­langan. Genlar rekon, muton kabi tarkibiy qismlardan tash­kil topganligi, genlarni kimyoviy yo'l bilan sintez qilish mumkinligi ma'lum bo'ldi. Bu sohada olingan ma'lumotlar irsiyatning genetik materiali bir butun yaxlit va uzluksiz­ligini isbotladi.




5-rasm. Hayot kitobi
II BOB Gen injenerligining xalq xo’jaligidagi ahamiyati
Biologik injeneriya deyilganda , organizmlar va biomuhitni inson uchun kerakli tomonga ma’lum bir maqsad bilan tubdan o’zgartirish tushuniladi. Masalan, gen injeneriyasining amalda, hammadan avval meditsina, veterinariya, mikrobiologiya sanoati va qishloq xo’jaligi rasm bo’lish istiqbollari shu qadar kengki, talaygina yetakchi olimlarning fikricha uning vujudga kelishi fan – texnika taraqqiyotida yangi davrni boshlab beradi. Gen injeneriyasi yadro fizikasi bilan bir qatorda zamonaviy fundamental fanning strategik yo’nalishlaridann biri bo’lib hisoblanadi.
Gen irsiyatning moddiy elementi, xromosomalar tarkibiga kiruvchi DNK molekulasining bir qismidir. U oqsil sintezida bevosita ishtirok etmagani holda oqsil molekulalari kodini tuzadi. Genning DNK molekulasida informasion RNK sintezlanadi, keyin aminokislotalardan oqsillar sintezlanayotgan mahalda uning o’zi matrisa bo’lib xizmat qiladi. Mana shun RNK ni – m RNK deb ataladi.
Oliy darajali organizmlarda DNK ning tuzilishi to’g’risidagi axborot unformasion RNK ga o’tkaziladi, shundan keyin tuzib olgan RNK yadro membranasi orqali hujayra sitoplazmasiga, oqsil sintezlanadigan joyga o’tadi.
Shunday qilib, gen – DNK ning bir qismi ekanligini biz bilamiz.
1952-yili amerikalik olimlar A. Xershi va M.Cheyz o’zlarining klassik tajribalari orqali bakteriyalarga fag yuqtirilganda fag oqsili bakteriya hujayrasining sirtida qolishi, fag DNK si esa hujayraning ichida bo’lishini ko’rsatib berishdi. Oradan ma’lum vaqt o’tganidan keyin, zararlangan hujayradan uning zararlanishiga sabab bo’lgan yangi faglar chiqa boshlaydi. Bu esa endi irsiyat to’g’risidagi ma’lumot faqta DNK da bo’lishini ko’rsatadigan dalil edi.
Organik ximiklar polimer bo’lmish DNK molekulasini kislotalar va yuqori temperatura ta’sirida parchalab ko’rdilar va bu molekula 5 uglerodli qand, fosfat kislota hamda 4 xil azotli asoslardan tarkib topganligiga ishonch hosil qildilar. DNK dagi qand fosfat kislota bilan navbat bilan joylashadi, har bir qandga esa azotli asoslardan biri birikkan bo’ladi. Qand fosfat va asos trium viratiga nukleotid deb nom berildi. 4 ta asosning 2 tasi purin asoslari – adenin (A), guanin (G), pirimidin asoslari, sitozin asoslari (S), (U) va timin (T) dir. Genetik kodning fikr qilib, mushohada yo’li bilan tuzilgan birinchi variantini G.Tamov degan amerikalik olim taklif etdi. 1954-yilda u DNK tekstini 4 harfli tildan 20 harfli oqsil tiliga ag’darish to’g’risidagi g’oyani ilgari surgan. 50-60-yillarda F.Krik o’z xodimlari bilan birga tanachalarning 3 ta DNK sini bitta aminokislota mos kelishini isbotlab berishdi. Ana shu “uchlik”ni kodon deb atashdi.
DNK ning bitta nukleotitidan oqsil bo’lmagan molekulalar, ya’ni ribose va transport RNK lari kodlanadi.
Kodning o’qilishini tashqaridan kiritikgan RNK da oqsil sintez qila oladigan hujayra elementlarini ko’rsatib berdi.
Amerikalik bioximiklar M.Nirenberg va G. Matten 1961-yili ichak tayoqchasidan olingan ekstraktga urasildan hosil qilingan polimerni qo’shib, shu ekstraktdan foydalanishdi. Shu tariqa hujayra sistemasi birinchi marta sinovdan o’tkazilgan edi. Tadqiqotchilar UUU kodonig qanday aminokislota mos kelarkan, degan savolni o’rtaga qo’yishdi. Shunda ichak tayoqchasi ekstrakti fenilaninga mos keladi deb javob berdi.
Juda qat’iy bir tartib bilan joylashgan uzundan-uzun polinukleotidlarning fermentlar yordamida sintezlanishi esa 60-yillarda endi hammani hayron qoldirgan gap bo’lib qoldi. O’sha polinukleotidlarni hujayrasiz sistemaga qo’shib ko’rish bilan ularning oqsil zanjirlariga mos kelishini osongina aniqlab olish mumkin bo’ldi. 1967-yilda, genetik kod nima ?, degan savolga to’liq javob olishdi.
Genetik kodni merganlar mo’ljalga olishadigan nishonga o’xshab ketadigan doira ko’rinishida tasvirlash mumkin. Unda “o’nlik” o’rniga birinchi, keying doiralarda – ikkinchi va uchinchi nukleotidlar kodonlarining xavf belgilari, chetida esa aminokislotalar kodonlariga mos keladigan xavf belgilari bo’ladi. Alohida turgan xavflar quyidagicha o’qiladi:

• 
  G – guanin
  
• 
  U – urasil
  
• 
  A – adenin
  
• 
  S – sitozin
  

Doiraning chetida uchta harfdan iborat bo’lgan tuzilmalar esa mana bu aminokislotalarni belgilaydi:

• 
  ALA – alanin
  
• 
  ARG – arginin
  
• 
  ASP – asparaginat kislota
  
• 
  VAL – valin va hokazo.
  

TER – simvoli bilan terminosiyalovchi, ya’ni pirovardiga yetkazuvchi uchta kodon belgilangan. Boshlab beruvchi kodonlar ikkita AUG (metioninga mos keladi) yoki GUG (valinga taaluqli).
Avvaliga buni faqat ichak tayoqchasining kodi deb o’ylashdi, lekin u har qanday boshqa organizmga ham to’g’ri kelgani uchun, uni universal deb topishdi. Obrazli qilib aytganda, lug’atni bosib chiqarishdi-yu, lekin maxsus fermentlar – DNK molekulasini juda ham tayinli joylaridan qirqib beradigan restriktazalar yordamida DNK fragmentlarini bo’lish usuli kashf etilmaguncha undan foydalana olmay turishdi. Restriktazadan foydalanib, DNK tuzilmalarini o’qib chiqish mumkin bo’ldi. Bu narsa tabiiy nuklein va oqsil bilan o’tkaziladigan tekshirish usullarini bir-biriga solishtirib ko’rish hamda kodning to’g’riligiga ishonch hosil qilish uchun imkon berdi. Kod gen injeneriyasiga doir ishlarni boshlashga asos bo’ldi, bu ishlash ichak tayoqchasidan boshlandi.
Xuddi ana shu ichak tayoqchasi yordamida yuqori darajali organizmlarning gormonlari, jumladan, odam insulin sintez qilindi, bu genetika va meditsina sanoatining eng kichik yutug’i bo’ldi.
Kutilmaganda boshqa faktlar ham paydo bo’lib qoldi. Biologlar bir necha o’n yillar mobaynida genetik apparat – genomlangan zanjiriga o’xshagan bo’ladi, uning har bir halqasi – geni juda mustahkam holatni egallab turadi deb hisoblab kelingan makkajo’xori ustida ish olib borayotgan amerikalik olima B. Mak. Klinton 40-yillarda birinchi bo’lib bunga shubha bildirdi. U harakatchan, mobil element (gen) lar bo’ladi deb gumon qiladi. 70-yillarda bakteriyalarda mobil elementlar (transpozonlar) topildi. Biroq yuqori darajali organizmlar genomining barqarorligi avvalgidek, shubha tug’dirmas edi. Toki makkajo’xori ustida qaytadan astoydil yana ishga tushirilmaguncha natijada uning nazorat qilib turuvchi elementlarning harakatchanligi va xromosomalarning qaytadan tuzilib, uzilib turishga sabab bo’lishi aniqlandi. Masalan, lokus (xromosomaning bitta genga mos keladigan qismi) lardan birining mustaqilligini yuzaga chiqaruvchi (Activator (Ac) – Dissociator (Ds)) oilasi shular jumlasidandir. Ds va As ishtirokida surila oladi, As esa mustaqil ravishda, o’z – o’zidan harakat qilishi mumkin.
“Plazmidalar” degan termin 50-yillarning birinchi yarmida D. Ledenberg tomonidan paydo bo’lgan. Bakteriyalar irsiyatining xromosomadan tashqarida bo’ladigan ana shu olimga bo’lgan qiziqishi o’sha paytdan boshlab tobora ortib bormoqda. Ulardan gen injineriyasining barcha usul va nazariyalarida vektorlar sifatida foydalanib kelindi.
Genetikadagi barcha muhim amaliy ishlarni, har qalay, xuddi plazmida vektorlari yordamida bajarilgan. Plazmidalarni o’rganish sohasi eng chapdast genetiklarning epchillik va iqtidorlikda kuch sinaydigan jangohga aylangan edi.
Dizenteriya ya’ni, ichburug’ kasalligiga sabab bo’ladigan grammanfiy enterobakteriyalarning ba’zi turlari ikki va hatto bir necha xil dorining har qanday katta dozalariga osongina bardosh berishini 1963-yilda yapon tadqiqotchilari isbotlab berishdi. Chidamli bakteriya shtamlari o’z chidamliligini boshqa bakteriyalarga ham o’tkaza oladi.
Dori preparatlariga nisbatan nasldan-naslga o’tadigan chidamlilikni paydo qiluvchi agentla bilan anterobakteriallar gruppasiga kiruvchi ichak tayoqchasining jinsiy omili o’rtasida umumiylik borligi tez orada ma’kum bo’ldi. Bu omillar “tabiatning” mushtarakligini payqagan olimlar ularni birlashtirib, plazmidalar qatoriga kiritishdi va xromosomalardan hali ravishda o’z – o’zini bunyod qiluvchi irsiy determinantlarni shular bilan belgilashdi. Shu vaqtgacha ajratib olingan plazmidalarning hammasi qo’sh zanjirchali halqasimon DNK molekulalari ko’rinishida ma’lum. Eukariotlar – hujayralarida yadrosi bor bo’lgan organizmlarda ham ana shunday hosilotlar bor.
Plazmidalar viruslardan farq qilib, xo’jayin hujayralardan tezroq ko’paya olmaydi, lekin o’sishda ularga hujayralar populyasiyalaridan orqada qolish ham to’g’ri kelmaydi.
Plazmidani λ d v tekshirish natijasida bu zarracha DNK qismining yo’qolib ketishi (delesilga uchrashi) natijasida λ fagdan (ichak tayoqchasi bakteriofagidan ) paydo bo’lishi aniqlandi.
Plazmidalar mayda bo’ladi (kattaligi 1.5dan 100 mln daltongacha) shuning uchun ham ular bilan in vitro (pobirkada), ishlashga yurmaydigan beso’naqay xromosomalar bilan ishlashdan ko’ra osonroq. Ikkinchidan, plazmidalarga joy-u rizqu-ro’z bergan xo’jayin – hujayralarning o’zlari ulardan osongina voz kechib, bemalol yashab ko’payaveradi. Buning ma’nosi shuki, sinchkov genetiklar plazmida tufayli hujayra xossalarini aniqlay olishlari mumkin. Genetiklar yangi xo’jayin hujayralarga DNK yetkazib berish uchun plazmidalardan foydalanishadi. Azot yig’ish geni Kubsiella bakteriyasidan E.coli (ichak tayoqchasi)ga o’tkazish ana shunga misol bo’la oladi.
Bu qanday qilinadi? Keling qarab ko’raylik. Tashqi pardasi qattiq bo’lmaydigan hujayralarni – sferoplastlarni olish uchun hujayralar mezosim degan maxsus modda bilan ishlanadi, bu modda sferoplastni yuqori osmotik bosim hosil qiladigan saxaroza ishtirokida uzilib ketishdan saqlaydi. So’ngra sferoplastlar detergent bilan eritiladi (lizis qilinadi) va shu tariqa hujayradan plazmida va xromosoma DNK sining beozozr chiqib kelishi ta’minlanadi. Sentrifugalash yo’li bilan bu ikkala DNK bir-biridan ajratiladi. Kichikroq plazmida molekulalari odatda borozgina xromosama DNK si fragmentlari bilan “ifloslangan” bo’lsa ham, har xolda tiniqlashgan mezotdagi cho’kma usti fraksiyasida qoladi. Cho’kmaga esa hujayra “siniqlari” ning asosiy qismi bilan butun qolgan yoki yirik fragmentlarga bo’linib ketgan xromosoma DNK sining asosiy qismi tushadi.
TRANSPOZONLAR
Transpozonlarning kashf etilishi genetik muxandislikning rivojlanishida muhim ahamiyatga ega bo’ldi. Ko’chib yuruvchi genetik elementlar-transpozonlarni o’simlik organizmida AKD1 olimasi Barbara Mak Klinton, Rossiya olimi Georgiy Georgiev kashf etgan.
Ko’chib yuruvchi genetik elementlar ayni vaqtda transpozitsion elementlar yoki transpozonlar deb ham ataladi. Transpozonlar xilma- xil strukturaga ega bo’lsalar-da, barcha transpozon molekulalarining ikki chetida maxsus nukleotidlar izchilligi, markaziy qismda esa DNK molekulasining belgilangan joyida "yopishqoq" uchlar hosil qilib notekis kesuvchi transpozaza fermentini sintez qiluvchi gen mavjuddir. Transpozaza fermenta hujayradagi DNK molekulasini "yopishqoq" uchlar hosil qilib kesadi va ayni paytda transpozon uchlariga qovushtiradi. Hosil bo’lgan xromosoma DNK si va transpozon DNK sidan iborat qovushma hujayra DNK bo’laklarini bog’lovchi ferment ligaza ta’sirida o’zaro bog’lanadi.
Transpozonlarning hujayra DNK siga integratsiyasi quyidagicha amalga oshadi. Transpozonlar xromosomada o’z o’rnini o’zgartirganda irsiyat ham o’zgaradi. Odatda yashash muhiti keskin o’zgarganda transpozonlarning ko’chib yurishi ortadi. Shu sababdan ko’chib yuruvchi genetik elementlar ishtirokida gen muhandisligiga asoslangan ko’pgina biotexnologik jarayonlar yaratilgan.
Xulosa qilib aytganimizda, gen muhandisligi biotexnologiyasining moddiy asoslariga, bakteriyalarni klonlash, transformatsiya va transduksiya jarayonlari, , transpozonlar, plazmidalar va restriksion endonukleaza fermentlarini to’la fundamental asoslarini o’rganish kiradi. Yuqorida qayd qilingan biologik faol moddalar gen muhandisligi biotexnologiyasining amaliy jarayonlarida o’ta qimmatli omil hisoblanadi.
Hozirgi kunda genlar kolleksiyalari va banklarini yaratish vazifasi har qachongidan ko’ra keskinroq bo’lib turibdi. Noyob, yo’qolib borayotgan va qimmatli o’simlik genlari dastasi (genofondi) ni saqlashning asosiy usuli ularni meriklonlar (meristema klonlari), kallus to’qimalar va hujayralar ko’rinishida kulturalar hamda in vitro saqlashdir.
Bu usul ehtiyotlab saqlab kelinayotgan formani har qanday miqdorda tez ko’paytirib olishga imkon beradi.
Individning to’satdan genetik o’zgarishga uchrab qolish ehtimoli, odatda, o’simliklarning tabiatda o’z-o’zidan (spontan ravishda) mutatsiyaga uchrab qolish darajasidan yuqori bo’lmaydi. Meriklonlar past darajadagi musbat temperaturada saqlanadi.
Biologlar to’qima, organ va hujayralarni suyuq azotda, ya’ni selsiy bo’yicha 196 gradusda qattiq muzlatish usullarini ishlab chiqishga kirishadi, bunday usul moddalar almashinuvini butunlay to’xtatib qo’yishdan tashqari, saqlash muddatining boshidan oxirigacha qanday bo’lmasin biror sezilarli molekulyar o’zgarishlarning bo’lishiga ham yo’l qo’ymaydi. Biroq bu o’rinda ham o’ziga yarasha mushkulliklar bor. Masalan, muzlatish – muzdan tushirish vaqtida bo’ladigan osmotic stresni har xil darajada yengil o’tadigan (yoki yemiradigan) hujayralarning o’ziga xos xususiyatlari, shular jumlasidandir. Ana shuning uchun ham maxsus tayyorgarlik ko’rish – to’qima, organ va hujayralarni “mashq qildirish” kimyolovchi birikmalarni (krioprotektorlarni)izlab toppish, saqlash metodlarini har bir tur uchun boringki , uning ayrim formalari uchun optimal holga keltirish zarur bo’ladi.
Bir qancha hollarda ba’zi aminokislotalar qo’shilgan muhitlarda oldin undirib olish va “chiniqtirish rejimini qo’llash o’rin bo’lib chiqadi. Har xolda bu usul jenshen va deltasimon dioskoreya hujayralarini qattiq muzlatishga qo’l keladi.
Ba’zi moddalar (qandlar, glisirin, demitilsulfoksid) muzlatish oldidan muhitga qo’yiladigan bo’lsa, krioprotektor rolini o’ynaydi.
Hayvonlarning genomlari(har xil funksiyalarni ado etadigan xromosomalar to’plami) muzlatilgan to’qimalar, sperma va xibrionlar ko’rinishida saqlanadi. Sovutish asta – sekin olib boriladi. Temperatura taxminan bir minutda bir gradusga tushurib turiladi. Selsiy bo’yicha -79-196 gradusgacha muzlatilgan to’qima va hujayralarni necha o’n yillab saqlash mumkin.
Buning iqtisodiy ifodasi yaqqol ko’rinib turibdi: sigirlarni sun’iy urchitishda bitta buqaning muzdan tushurilgan spermasidan foydalanib yiliga 10 ming boshgacha buzoq olinadi. Muzlatilgan spermani istalgan masofadagi joyga yetkazib berilishi mumkin. Odam hujayralarining o’sishidan meditsinada irsiy kasalliklarni aniqlash, patogenezni o’rganish va uning davolash usullarini topishda foydalanadi. Mana shuning uchun hozir ko’pgina normal va mutant hujayralari kolleksiyalari (muziylari, banklari, repozitoriylari) yaratilmoqda va ulardan keng foydalanilmoqda. Jahondagi eng yirik repozitoriy Koliden (AQSH) dagi meditsina tadqiqotchilari institutining “odam mutant hujayralari repozitoriysidir. Uning kolleksiyasida 3600 tadan ko’proq namuna bor. Hujayralardan boshqa amaliy ishlarda tekshirish va o’rganish maqsadlarida: hujayra tuzilishini genetik nazorat qilish, genetik shikastlarni mutagenezni bartaraf etish (reparasiyalash, tiklash) va genetik “injenerlar” ning ishlarida ham foydalanadi. Individual genlarni ajratib olish va ko’paytirish (klonlash) usuli ham bor. Bu usul molekulyar genetiklar orasida “sochma o’q usuli”deb nom olgan. Uning ish prinsipi mana bunday ko’rinishda bo’ladi. Dastlab DNK ni uzun –uzun bo’laklarga kesib beradigan restriktazalar bilan ishlanadi. Ammo bir oz boshqacharoq ham qilish mumkin , ya’ni DNK ga ultra tovush yuborish bilan uni bo’laklarga ajratsa bo’ladi. Lekin bu holda uchi “yopishmaydigan” DNK bo’laklari olinadi. Bunda ularning uchlariga yopishqoq boshqa bo’lak uchlarini chatib qo’yishga yoki DNK uchlarini birlashtiradigan megazadan foydalanishga to’g’ri keladi.
Genetik – biokimyogarlar ham DNK fragmentlari aralashmasini tadqiqotchi tanlagan genni bakteriyaga yetkazib berish kerak bo’lgan tegishli vektorlar (maxsus yasalgan plazmidalar, bakteriofaglaryoki virus) bilan ma’lum sharoitlarda aralashtirishadi, bakteriyalar ko’payib bir yo’la egizak genlarni ham ko’paytirib yuboradi. “sochma o’q usuli” yordamida qanday bo’lmasin biror organizm genlarining banki yaratiladi. Buni ishga avvaliga ichak tayoqchasidan boshlangan, keyin odamga ham o’tishgan. Masalan, Eleyn Leyk (Helene Lake) degan negr ayolidan olingan o’sma hujayralar Hela degan nom bilan dunyoning barcha laboratoriyalarida o’stirilmoqda. Hozir har xil inson irqlari va populyasiyalari genomlari – DNK kolleksiyalari banklari yaratilmoqda.
Umumiy aytgandan, amaliy maqsadlar uchun aksari genning o’zi emas, balki o’sha gen kodlab beradigan oqsil kerak. Buni olish uchun vektorga (odamda plazmidaga) kiritilgan. DNK da matrisa RNK si sintezlanishi, unda esa oqsil sintezlanishi lozim. Bordi-yu, shakllangan yadrosi bo’lmaydigan bakteriyalar bilan ishlanadigan bo’lsa, buni uddalash oson.
Yadroli organizmlarning genlarida faollik ko’rsatadigan intronlarning borligi aniqlandi. Intronlar o’zicha faol bo’ladi, faqat ularning bunday “yashirin” faoliyatini endigina aniqlanmoqda. Hujayrada bu elementlar odatda RNK – trankriptidan kesib olinadi, faol elementlar esa matrisa RNK siga megazalar bilan tikiladi. Juda ko’p kashfiyotlardan keyin bir nechta laboratoriyada revertaza yordamida gemoglabinning oqsil qismi, ya’ni globin geni sintezlandi, kalamush insulini va odamda bo’ladigan o’sish garmoni – somatostatin gormonining geni esa hozirgi zamonda tabiiy bo’lmagan oqsilni yetkazib beruvchi bosh manba – odam va hayvonlar ichagida yashaydigan harakatchan bakteriya – ichak tayoqchasida ishga tushdi.
Hozir tadqiqotchilar tirik hujayralarni olib, butunlay boshqa organizm genlarini o’ziga jo qilgan hujayralarni yaratish uchun foydalangan holda avvallari planetada uchratilmagan hayvonlarni yoki uchragan bo’lsa ham, yangi belgi va xossalarga ega bo’lgan mavjudotlarni yaratish mumkin bo’ladi, deb isbot qilishmoqda. Masalan, yuqori darajali hayvon va odam genlari payvandlab qo’yilgan bakteriyalar muhim oqsilga o’xshaydigan protein yoki odamga xos bo’lgan garmonlar ishlab chiqarilishi mumkin. Bunday ishlar bilan o’zlarini gen injinerlari deb ataydigan molekulyar – biologlar shug’ullanadilar.
Gen injeneriyasi deganda, genetiklar ayrim genlarni ajratib olib, bir hujayradan boshqasiga ko’chirib o’tkazish yo’li bilan irsiyatni ma’lum yo’nalishda o’zgartirib boorish usullarini ishlab chiquvchi biologiya sohasini tushuniladi. Genetik material har xil usul amallar bilan ko’chirib o’tkaziladi. Masalan, tozalangan DNK preparatlaridan foydalanib shunday qilinadi, bunda “operasiya qilinayotgan” hujayrallardagi (bunday hujayra resipient – hujayra deb ataladi) DNK ning ayrim joylari shu preparatlar bilan alishtirib qoyiladi. Genetik materialni ba’zan viruslar, bakteriofaglar (virus bakteriyalari) yoki bakteriya plazmidalar yordamida ko’chirib o’tkazish mumkin. Genlarni ko’chirib o’tkazishga doir tajribalarda genetiklar odatda kasallik tug’diruvchi bakteriyalar va o’simlik viruslarining plazmidalarini, genlarni hayvon hujayralariga joylashda esa hayvon viruslarini ishlatishadi. Nihoyat, yot jinsli hujayralarni sun’iy yo’l bilan shunchaki bir-biriga qo’shish va shu tariqa hosil qilingan duragayni o’z-o’zini bunyod qilib turishga majbur etish mumkin.
Ajratib olingan DNK lar yordamida duragay DNK lar yaratiladi. Bakteriya hujayrasining duragay DNK ni o’ziga olishga majbur etish uchun, uni hujayra pardasi o’tkazuvchanligini oshiradigan Ca tuzlari yordamida “karaxt qilib” qo’yiladi, so’ngra hujayra suspensiyasiga tarkibida duragay molekulalar bo’lgan eritma qo’shiladi. Bu molekulalarning ba’zilari “karaxt qilib” qo’yilgan hujayralar ichiga o’tib, odatda o’sha hujayra DNK si “qiyofasiga kirib” oladida, “o’rnashib olganidan” keyin hujayraga “o’z amrini o’tkazaveradi ”, masalan, o’sha hujayrani unga xos bo’lmagan miqdorda qanday bo’lmasin biror yangi oqsil, oqsilni yoki ma’lum bir aminokislotani ishlab chiqarishga majbur qilaveradi.
Rekombinant DNK molekulalari qanday qilib olinadi?
Ikkita organizmning dastlabki, DNK molekulalarini alohida fermentlar restriktazalar yordamida bo’lak-bo’lak qilib kesiladi. Bunday fermentlarning bir necha o’ntasi ma’lum. Shu bilan birga har bir restriktaza DNK ni juda tayinli bir joyidan: masalan, ichak tayoqchasidan olinadigan ferment – adenine bilan guaninning o’rtasidan kesadi. Shu sababdan ham ikkita har xil DNK sini kesish uchun bitta restriktazadan foydalaniladi. Ularni kesilgan joyidan “tikib qo’yish” uncha qiyin emas. Buning uchun ana shu yot jinsli DNK bo’laklarini aralashtirish kerak, ular o’zlari “tikilib qoladi”.
Ba’zan qardosh bo’laklar ham qo’shilib “tikilib ketadi” – bunda bitta organizm DNK si tiklanadi. Ba’zida ikkita organizm bo’laklari “tikilib qoladi” – bu rekombinant DNK. Lekin genetiklar bu ish uchun ko’pgina ligaza fermentidan foydalanishadi (6-rasm).


Gen injeneriyasi hozircha meditsina va veterinariyada samarali ishlamoqda. Chunonchi, gen injeneriyalari odam insulin ishlab chiqaradigan bakteriya tuzishdi. Shu garmonning yetishmasligidan azoblanadigan odamlar ko’p, - taxminan yigirma kishidan bittasi. Diabet kasalligi bilan og’rigan bemorlar hozircha qushxonalarda olinadigan insulinga qaramdir. Lekin bu insulin hammaga ham haf beravermaydi va buning ustiga shu qadar qimmat turadiki, kapitalistik mamlakatlarda oddiy mehnatkashning unga qurbi yetmaydi.Gen injeneriyasi yordamida irsiy kasalikka duchor bo’lgan ikkita bemorda nuqsonli genlar almashtirilishi bilan ularning hayoti saqlab qolindi.
Interferon – ya’ni, virusga qarshi modda olindi, AQSH da esa bo’yi yaxshi o’smaydigan bolalar uchun o’sish garmoni sotuvga chiqarildi.
Gormonlar bilan olib boriladigan tajribani bolalardan ko’ra hayvonlar ustida o’tkazish bexatardir. AQSH da kalamushlarning o’sish garmoni sichqonlarga “ishlatildi”. Natijada sichqonlar odamdagidan ko’ra bir yarim barobar yiriklashib ketdi. Buning ma’nosi shuki, foydali uy hayvonlarida ham ana shunday gen operasiyani o’tkazish mumkin. Hozircha esa, o’sha joyda AQSH da gen injineriyasi usullari bilan qoramolning o’sish garmoni yaratildi.
Gen injeneriyasi yutuqlaridan darak beradigan ishonchli xabar sobiq SSSR fanlar akademiyasi bise-prezidenti akadenik Yu.Ovchinnikovning “Pravda” gazetasi (1984-yil 19-iyun soni)dagi maqolasida bosilib chiqqan: “gen injeneriyasidagi tajribalari nihoyat darajada murakkab”. Lekin shunday bo’lsa ham, bu sohadagi ish sur’atlari shiddat bilan ortib bormoqda. Masalan, odam organizmi hujayralaridan regulyatsiya ishtirok etuvchi eng muhim oqsillar – gemoglobin, insulin, interferon va boshqalar biosinteziga daxldor genlarni ajratib olish mumkin. Keyin bu genlar tez o’suvchi mikroorganizmlarga payvand qilindi va shu yo’l bilan odam organizmining ilgargilari sira yaqinlashib bo’lmagan bioregulyatorni olish mumkin bo’lib qoldi. Bular zamonaviy dorilar bo’lib, odam uchun tabiiy va shu bilan bir vaqtda virus kasalliklari va boshqalarga qarshi kurashning universal vositalaridir. Xususan, shunday yo’l bilan Sobiq Sovet Ittifoqida yaqinda odam interferonining dastlabki sanoat partiyalari olindi, insulin va o’sish garmoni bo’yicha shunday ishlarning natijalarini amaliyotga joriy etish poyoniga yetib qoldi.
Rekombinant DNK lar usuli bilan mamlakatimizda almashtirib bo’lmaydigan eng muhim aminokislota – treoninni juda ko’plab ishlab chiqaradigan mikroorganizm ham olindi.
Treonin ustida alohida to’xtalib o’tamiz. Shu aminokislotani juda ko’plab ishlab beradigan mikroorganizm, ya’ni treonin o’ta produsentini yaratish uchun ichak tayoqchasi – molekulyar genetikada eng sevib ishlatiladigan ob’ekt tanlandi. Normal xoldagi ichak tayoqchasi aminokislotalar bilan bir qatorda treonin ham sintezlaydi, lekin sintezlanganida ham, o’ziga qancha kerak bo’lsa xuddi shuncha sintezlaydi. Shu sababdan biologlarga avval bu mikroorganizmni oddiy seleksiya usullari bilan ana shu ksmsuqumlikdan xalos etishga to’g’ri keldi. Biologlar ko’pdan – ko’p ichak tayoqcha mutantlari orasida ortiqcha trioninni pisand qilmaydiga xilini qidirib topishdi.
Maxsus usullar bilan bakteriyalarga treoninni keskin ko’paytiradigan genlar ko’chirib o’tkazildi. Bakteriyalarning o’ta sintez qilish layoqati bir necha avloddan keyin yo’qolib ketishi ma’lum bo’ldi. Shundan keyin bakteriyalarga sintetik aktivlikni pasaytiradigan hujayralarning o’z-o’zidan yo’qolib ketishiga olib keluchi genlarni ko’chirib o’tkazishga to’g’ri keldi. Gen injeneriyasining qo’lga kiritgan yutuqlari biotexnologiyani, ya’ni nazorat qilib turadigan sharoitlarda biologic agentlar biologik jarayonlardan foydalanishga asoslangan ishlab chiqarish texnologiyasini jadal rivojlantirish uchun turtki bo’lib xizmat qildi.
Zamonaviy biotexnologiya hozirgi kundagi asosiy masalalarni oziq-ovqat muammosi, energetik krizis, atrof-muhitning ifloslanishi masalalarini hal qilish bilan uzviy bog’langan.
Yer yuzida insonlarning soni jadallik bilan ortayotgan bir vaqtda oziq-ovqatga bo’lgan talabni qondirish, o’simlikshunoslik va chorvachilikning samaradorligini oshirishni talab qiladi, shuning uchun biotexnologiyani asosiy e’tibori shu muammolarni yechishga qaratilgan (7-rasm).

Biotexnologiya ko’p qirrali sohadir: u keng ma’nodagi mikrobiologik sintez, gen va hujayra injineriya, hayvon hamda o’simlik hujayralari va to’qimalarini o’stirish immun biotexnologiya, qishloq xo’jalik ekinlari va zararkunandalariga qarshi biologik yo’l bilan kurashish, hayvonlarni sun’iy yo’l bilan urug’lantirish va embrionlarini ko’chirib o’tkazish singari sohalarni shuningdek, qanchadan – qancha boshqa narsalarni o’z ichiga oladi.

Gen injeneriyasi usullari biotexnologiyaga tabiiy yondashib, biotexnologik jarayonlarning qo’llanish sohasini kengaytiradi va samaradorligini oshiradi.
Gen injeneriyasi sohasidagi qishloq xo’jalik tadqiqotlari asosan ikki yo’nalishda jam qilinmoqda. Birinchisi, chorvachilikda ishlatiladigan vaksinalar, garmonlar, oziq qo’shimchalari, pestisidlar va o’g’itlarni ko’plab ishlab chiqaradigan produsentlar olish uchun mikroorganizmlarni genetik jihatdan rekonstruksiya qilish; ikkinchisi, o’z-o’zidan o’g’itlanadigan qishloq xo’jalik ekinlarini yoki juda yaxshi fotosintez qila oladigan, tuproq sho’rligi, kasalliklar, pastisidlarga chidamli bo’lgan ekinlarni yaratish, chorvachilik sohasida esa hayvonlarni klonlash texnologiyasini mahsulotlarini oshirish maqsadida yuqori darajali organizmlarni qayta qurish.
Bu yo’nalishlarning birinchisi hozirda yaxshi samara bermoqda. Yaqin yillar ichida suv o’tlardan hayvon oqsili pishloq pishirish uchun zarur bo’lgan rennin, charvachilikda ishlatiladigan oziq qo’shimchalariga kerakli amonikislotalar ishlab chiqarish, neft mahsulotalarini genetik jihatdan “qayta tarbiyalangan ” bakteriyalar yordamida protein va pestisidlarga aylabtirish batamom yo’lga qo’yiladi.
Yaponiyada aminokislotalar ishlab chiqarish uchun “shartnoma ” tuzilgan.
Bakteriyalar bilan zamburug’larning mahsulotlarini oshirish uchun hozirning o’zida gen injeneriyasidan foydalanilmoqda. Vaksina va zardob olish uchun bakteriya hujayralariga pathogen virusning pardalari oqsilini kodlaydigan genlar ko’chirib o’tkazilgan. Bunday oqsillar kasalliklar paydo bo’lish ehtimolligini istisno qiladi, inson va hayvonlarni kasalliklardan asraydi. Hozirning o’zida oqsil kasalligi infeksion gepatitga qarshi samarali vaksinalar yaratilgan shuningdek, gripp virusi genlarini klonlashga oid ishlar olib borilmoqda. Muhit muhofazasi uchun neft uglevodorodlarini parchalaydigan psevdomonas bakteriya shtammlari konstruksiya qilinmoqda. Chet elda hozirda ko’p plazmidali psevdomonas variant olingan, u neftning hamma tarkibiy qismlarini o’zlashtitradi.
Hujayralarda o’simliklar jadal seleksiya qilinishi mumkin, chunki mutagenez kuchaytirilib, ba’zi belgilar, aytaylik, kasallik, pestisid, tuproq sho’rligi va boshqa stress sharoitlariga chidamlilik jihatidan tanlash samaradorligi oshirilishi mumkin.
O’simlik to’qimalarini fermentlarda o’stirish piretrin (tabiiy pestisid) singari o’simlik mahsulotlarini, angishvonagul, jenshen va boshqa o’simliklardan olinadigan farmokologik preparatlarni sanoat yo’li bilan ishlab chiqarish to’g’risida gapirishga imkon beradi.
Mamlakatimizda hujayra biomassasidan jenshen nastoykasi olish uchun sanoat gerlamenti ishlab chiqilgan. O’simlik protoplastlari (pardasiz hujayralar) dagi yot jinsli genetik material genlarni olib o’tkazuvchi vektorlarsiz, to’g’rida – to’g’ri o’simlik hujayrasiga joylanishi mumkin. Agronomiya gen injeneriyasi havodan azotni o’zlashtirib olishni belgilab beradigan gif genlarini azot to’plovchi bakteriyalardan azotni to’play olmaydigan mikrofloraga ko’chirib o’tkazish yo’li bilan xosildorlikni oshirishni shuningdek, dukkaklimas o’simliklarning azot to’plovchilar bilan birgalikda yashash layoqatini payvandlash yoki kuchaytirishni ko’zda tutadi. Ma’lum bo’lishicha, azot to’plashni belgilovchi genlar azot to’plovchi xilma-xil prokariotik (yadrosiz) mikroorganizmlarda ko’p jihatdan bir – biriga o’xshash bo’lar ekan, bu ularni ko’chirib o’tkazish uchun juda yaxshi istaklar ochdi.
Topilgan azot to’plovchi mikroorganizmlarning ko’pligi g’alla ekinlari – sholi, makkajo’xori, bug’doy va boshqalarning ildiz zonasida yashaydi.
Tokio universitetida ularga dukkaklilarning tugunak bakteriyalaridan rizobiylardan azot to’plash genini ko’chirib o’tkazish yo’li bilan bularning hosildorligini oshirish yuzasidan tajribalar olib borilmoqda. Buyuk Britaniyadagi Agronomiya ilmiy tekshirish institutida azot to’plash genini azot to’plamaydigan tuproq bakteriyalariga o’tkazishga urinishdilar.
Kallusdan bekamiko’st o’simlik yaratilishiga 2 yo’l bilan erishiladi: sitokinin va auksin degan gormonlar nisbatini o’zgartirib turib novda va ildizlarini paydo qilish yo’li. Ana shu samotik embriogenez dastlab, 1959-yilga kelib sabzida kuzatilgan edi.
Bug’doy va archa kallusidan sovuqqa juda chidamli hujayralar tanlab olindi. Ajratib olingan hujayralar in vivo holatda, ya’ni tirik organizm tanasida turgan vaqtda ishlab chiqaradigan moddalarni, vitaminlar, garmonlar, alkoloidlar, kumarinlar, steroledlar va hokazolarni sintezlash layoqatini saqlab qoladi. Mutagenlar, ya’ni irsiy o’zgarishlarni keltirib chiqaradigan moddalar yoki radiasil ta’sir ettirish o’zgarib qolgan hujayralar sonini ko’paytiradi, selektiv shart-sharoitlardan foydalanish esa inson uchun kerakli yo’nalishda o’zgargan hujayralargina ko’paytirib boorish uchun zamin tug’diradi.

2.1 Kichik plazmidalar, bakteriofaglar va kasmidalardan yot genlarni klonlashda vektor sifatida foydalanish

Eco R1 yopishqoq uchli fragmentlar hosil qilishi ma’lum bo’lgandan keyin har xil DNK fragmentlarini sistematik klonlash usuli topildi. Uning asosiga Eco R1 -fragmentli DNK molekulasini halqali plazmida DNK kiritish yotadi.
Bu gibrid plazmida hosil bo’lishiga olib keladi, uni bakteriya hujayrasiga kiritish mumkin. Bunda har bir hujayra uzida yot DNK fragmentini biriktirgan plazmidagi kiritishi mumkin. Birinchi shunday ekperimentlarda E.colining rSC101 plazmidalidan foydalanildi, chunki u Eco R1 parchalanishini bitta saytiga ega va demak u restriktaza ta’sirida chiziqli molekulaga aylanadi. Bunday DNK xuddi shunday yopishqoq uchli yot DNK bilan aralashtirilganda yangi gibrid plazmida hosil bo’ladi. Ularning har birida xech bo’lmasa yot DNK fragmenti bo’lib, plazmidaning Eco R1 saytiga birikib olgan bo’ladi.
Izlanuvchi vektor xususiyatini hujayra xususiyatlariga moslashtirishi zarur. Vektorda genetik marker bo’lib, shunga qarab seleksiya o’tkazish mumkin. Prokariot sistemalarda ko’pincha bu har xil antibiotiklar - ampisilin, tetrasiklin v. xzoga chidamlilik markeri mavjud. Xo’jayin-hujayrasi rekombinant DNK molekulasi funksiyalashning uchun eng birinchi muhitdir. Hozirgi vaqtda ko’pincha E.coli, B.subtilis, achitqi va boshqa mikroorganizmlar qo’llaniladi.
Rekombinant DNK hujayraga kiritilgandan keyin (transformasiya) molekulyar klonlashtirish, ya’ni hosil qilini rekombinant DNK avlodini olish boshlanadi. Buning uchun transformasiyalangan hujayralar o’sishi uchun sharoit yaratiladi. Masalan: muhitga u yoki bu antibiotik kushiladi. Oxirida absolyut gomogen shtamm olinadi, undan quyilgan maksadi karib klonlangan gen yoki uning mahsuloti ajratib olinadi.
Plazmidli vektor pBR322 2 xil genetik markerni uz ichiga oladi ampisillin (AR) va tetrasiklin(Ts) antibiotiklariga rezistentlik. Restriksiyalovchi endonukleazalar Bam HI yordamida polinukleotid xalka Te geni qismida uziladi-kesiladi. Natijasida 5'-GATCli yopishqoq uchlar paydo bo’ladi va Te gen inaktivlanadi.5'-GATC uchli sintetik gen olinadi. Bu gen va uzilgan vektor pBR322 ligaza T4 fermenti yordamida uzilgan bog’lar tiklanadi va aksariyat hollarda sintetik gen vektorga birikladi va rekombinant DNK hosil qiladi(8-rasm).

Aralashmada endi ikki xil navli siklik molekulalar - pBR 322 vektorlari va rekombinant gen tashuvchi plazmidalar bo’ladi.

Ular ampisillinga rezistent (chidamili), lekin vektor tetrasiklinga ham rezistent bo’ladi, rekombinant plazmidalar esa aknlcha chidamsizdir.
Bu esa selektiv muhitda kerakli geni bo’lgan rekombinantlarni ajratish imkonini beradi. Gen injeneriyasi uzining birinchi kadami bilan yangi kutilmagan xodisalarni ochdi.
Bunday yangiliklarga birinchi navbatda eukariot genlarning mozaik strukturasi kiradi,ya’ni ular oqsilni kodlovchi qism (ekzonlar) va oraliq (intron) , oqsilga aloqasi bo’lmagan qismlardan iboratligi aniklandi.
Genlarning mozaik strukturasining aniklanishi muhim ahamiyatga ega bo’ladi, u avval ma’lum bo’lmagan iRNKning hosil bo’lish etapini ochishga olib keldi, ya’ni birlamchi nusxadan intronning kesib olinishi va ekzonning biriktirib iRNKning oxirgi shakllangannin olishga olib keldi.
DNKni plazmida tarkibida klonlab xromosoma genlarining strukturasini to’g’ridan- to’g’ri urganish mumkin, lekin ulardan transkripsiyalanadigan mRNKni emas. Lekin kodlanadigan gendan tashkarida bo’lgan regulyasiyalaydigan tartiblarni urganish uchun xromosoma DNKsining ancha uzun fragmentlari bilan manipulyasiya qilishga to’g’ri keladi. Amalda minglab ximera plazmida olish mumkin, ularning har biri DNK (odam, sichqon, tovuq)ning spesifik fragmentlariga ega bo’ladi. Ko’p sondagi bunday plazmidalarini skrininglab bu organizmlarning to’liq genomini o’rganish mumkin. Lekin katta DNK bo’lagiga ega bo’lgan plazmida barkaror bo’lmaydi, replikasiyada sekin asta kichrayib boradi, ya’ni delesiya natijasida yot DNK nukleotidlari soni kamayib boradi. Buning sababi shundaki, plazmida kancha kichik bo’lsa shuncha tez replikasiyalanadi. Shu sababli plazmida ko’payishi uchun kerak bo’lmagan genetik material tez yo’qoladi. Delesiya chastotasi kDNK klonida bir necha mingdan ko’p nukleotidlar bo’lsa ancha ortadi.
Xromosoma DNKsining katta bo’lanlari (15 kv) plazmida tarkibida juda ham barqaror emas, lekin ularni biz maxsus konstruksiyalangan L fagi shtammlariga biriktirsak ancha barqoror bo’lib qoladi.
Faglar eukariotlarining spesifik genlariga ega bo’lgan, "bibliotekasi" olinandan keyin uni plazmidaga klonlangan kDNK yordamida oson skrisninglash mumkin. Bunda ham radioaktiv nishonlanganlangan zondlar yordamida kDNKga komplementar tartibga ega bo’lgan fag koloniyalari identifikasiyalanadi. Sut emizuvchilar gaploid nabor xromosomalari 3*10 juft asoslarga ega. DNK L fagga klonlanganda har bir fragment o’rtacha 1,5*10 juft nukleotidda iborat bo’ladi. Shunday qilib faqat 1mln fagning skrining sut emizuvchilarning butun genomini urganish imkonini beradi. Agar spesifik kDNK bo’lsa, kerakli genni Lfagi bibliotekasidan topish ko’pi bilan bir necha xafta vaqtni oladi (9-rasm)



Fagda klonlangandi eukariotik genom segmentining o’lchovi 15kv bilan chegaralanadi. Ko’p xollarda bu butun gen va u bilan boglik tartiblar olish uchun etarlidir. Lekin izlanishlar shuni kursatadiki ko’p genlar ancha uzun bo’lib ular 35-40 kv nukleotidlarga ega bo’ladi. Undan tashkari L fagida klonlab odatda 2ta yakin turgan genlardan rekombinant DNK ajratish mumkin emas. Juda uzun eukariotip DNK fragmentlarini E.colida klonlash kasmidalarda olib boriladi. Bu usul shuncha asoslangaki L fag DNKsi 2ta uchida komplementar bir zanjirli qism bo’lib unga cos-sayt deb ataladi. Fagning normal hayotiy siklida fagning yuzlab DNK molekulalari uzun zajiirga birikadi, ya’ni konkotamerga birikadi, bunda L fagi har biri boshqasi bilan cos-sayt bilan birikkan bo’ladi.
Fag DNKsini joylashishini (ulolovka) katalizlovchi fermentlar bu konkatemerda 2ta bir biridan 35-45 kv mosofada turgan cos-saytlarni toniydi va ular oraligida turgan fag genomini kesib ajratadi va uni fag boshchasiga joylashtiradi. Shunday qilib cos-sayt bu DNKni fag boshchasiga joylashishida muhimd (10-rasm).

Lfagi cos-sayti pBR322 plazmidaning ampisillinga chidamliligiga klonlanib, tetrasiklinga chidamlilik gen faol saqlanib qoladi. Eukariotik DNK-restriktaza yordamida kisman gidrolizlanadi. Bunda nisbatan uzun DNK fragmentlari hosil bo’ladi. Keyin bu fragmentlar aralashmasi plazmidaning cos-sayti bilan biriktiriladi. Sos-sayt ham shu ferment yordamida gidrolizlanadi. Bunda intakt TetR genni intakt DNK ximera aralashmasi hosil bo’ladi. Bu aralashmada eukariotik DNK fragmenti cos-sayt bilan tugagan.

Bu aralashmaga L fagi DNKsini joylashishini katalizlovchi ekstrakt qo’shilganda, 35-45 kv eukariotik DNK fragmentlarini taniydi va ajralish sodir bo’ladi va ular fag boshchasiga joylashadi. Eukariotik DNKning qisqa fragmentlari ularda cos-sayt bo’lsa ham fag boshida joylashmaydi. Bunday DNKli fag boshchasi anikki ko’paya olmaydi . Sungra ular bilan ishlov berilgan E.coli tetrasiklinga chidamliligi buyicha tanlanadi. E.coli ichiga tushgandan keyin gibrid molekula plazmida kabi ko’payadi. Kasmidalarda klonlash effektivligi fagga qaraganda past va kosmida bibliotekasini kam miqdorda DNK bo’lgan organizmlar bilan ishlaganda olish qulay (masalan: drozofila).