Kafedrasi “biotexnologiya” fanidan o‘quv-uslubiy majmua

Ikkilamchi emulgirlash. Bu yo’l bilan immobilizasiya qilganda, avvalo fermentni suvdagi eritmasini organik polimerdagi emulsiyasi tayyorlanadi. Tayyor emulsiyani yana bir bor suvda dispersiya qilinadi. Natijada, fermentni suvdagi eritmasini saqlagan organik moddani (polimerni) emulsiyasi hosil bo’ladi. Vaqt o’tishi bilan organik eritma qotadi, va immobillashgan ferment saqlovchi polimer zarrachalari hosil bo’ladi. 1972 yilda S.Mey va N.Li lar bu usulni modifikasiya qildilar va membrana hosil qiluvchi materialar sifatida suvda erimaydigan polimer o’rniga katta molekulyar massaga ega bo’lgan suyuq uglevodorodlardan foydalanishni tavsiya qildilar. Bu usul suyuq membranalarda immobilizasiya qilish deb ataldi. Bundan tashqari tolaga kiritish, liposomaga kiritish, mikroemulsiya hosil qilish kabi bir qator usullar mavjud.


Fermentlarni kimyoviy usulda immobillash


Fermentlarni kovalent birlashtirish imkonini beruvchi kimyoviy o‘tishlar asosiy qiziqishlarni namoyon etadi (kataliz uchun ahamiyatli bo‘lmagan funktsional guruhlari orqali, jumladan, -NH2, -COOH, -SH, -OH va boshqalar) neorganik tashuvchilarga (masalan, g‘ovak shisha, keramika, temir), tabiiy materiallarga (masalan, tsellyuloza, xitin, dekstran, agaroza) yoki sintetik polimerlarga (masalan, naylon, polistirol, poliakrilamid, ionalmashuvchi smolalar). Tashuvchilarga etarli darajadagi yuqori bog‘lanuvchanlik qobiliyatini berish uchun ba’zan uning sirtini “faollantirish” ga to‘g‘ri keladi. 1-rasmda oqsilning polisaxarid matritsasidagi immobillashning klassik metodlari keltirilgan. Birinchi bosqichda tashuvchi kaliy peryodat alьdegid guruh paydo bo‘lgunga qadar oksidlanadi keyin ferment aktivlangan tashuvchi hamda azometin bog‘lari bilan bog‘lanadi va oxirida oqsil hamda tashuvchi orasidagi bog‘larga yuqori barqarorlik berish maqsadida natriy borgidrid bilan tiklanadi. Boshqa misol-sopolimerizatsiya metodi (2-rasm). Birinchi bosqichda sopolimerizatsiyalanishga qulaylik uchun ferment molekulasiga qo‘shbog‘lar kiritiladi; masalan, ferment akriloilxlorid bilan atsillanadi; keyin akriloirlangan fermentni monomer eritmasiga kiritiladi va sopolimerizatsiyalanadi. Natijada ferment gelning polimer to‘riga kimyoviy “tikilgan” ko‘rinishga kiradi. Tashuvchini tanlash va immobilizatsion metod, fermentning tabiatiga va qaysi maqsadda ishlatishga qaratilganligiga bog‘liq bo‘ladi. Adabiyotlarda bu savollarga foydali maslahatlarni topish mumkin. Tashuvchining geometrik ko‘rinishlari turli ko‘rinishlarda bo‘lishi mumkin; kichik granulalar, jumladan, sharchalar, trubachalar, tola, g‘ovak plastinalar (filьtrlar), yarimo‘tkazuvchi membranalar va boshqa turlari keng qo‘llaniladi. Qisman olganda fermentning polielektroyait kompleksidagi egallab olinishiga asoslangan immobillash metodi [12], tashuvchini suvda eriydigan holatdan suvda erimaydigan holatga o‘tkazish (eritmaning ion kuchi yoki rN ini o‘zgartirish yo‘li bilan) va teskarisini bajarish imkonini beradi. Immobillangan fermentning harakat kinetikasiga tashuvchi jiddiy ta’sir ko‘rsatishi mumkin. Shuning uchun quyidagilarni yodda tutish zarur: ichki va tashqi diffuzion qiyinchiliklarni, fermentning makromolekulyar substratlari bilan reaktsiyalaridagi sterik to‘siqlarni, substratlar, ingibitorlar, vodorod va boshqa effektorlarining suvli eritma va matritsa oralig‘idagi yoyilishini (elektrostatik yoki gidrofob bog‘lanishlar, vodorod bog‘lanishlar hisobiga). Bu effektlarning ba’zilari to‘g‘ri kelmaydi va ular bilan boshqa tashuvchi olish yoki immobillanish sharoitini tanlash orqali kurashishga to‘g‘ri keladi. Boshqa tarafdan, masalan, yoyilish effektlaridan katalizatorga boshqa xususiyatlarini berish uchun maqsadga muvofiq ravishda foydalanish mumkin. Anionli polielektrolitlardagi immobillanishida (3-rasm, a ) manfiy zaryadga ega matritsa zonasidagi gidroksil ionlarining kontsentrlanishi sodir bo‘ladi, bu esa eritma bilan solishtirilganda ferment mikroo‘ramini xarakterlovchi rN ning lokal qiymatini “kislotali tomonga” siljishini ta’minlaydi. Natijada kuzatilayotgan katalitik aktivlikning rN profili bufer rN ining yuqori qiymatli tomonlariga tomon o‘zgaradi. Kation polielektrolitdagi immobillashda teskari bog‘liqlik uchun joy bo‘ladi (3-rasm, b).

1-rasm. Fermentning polisaxaridli tashuvchiga kovalent birikishi.

2-rasm. Fermentning polimer geldagi immobillanishi uchun sopolimerlanish metodi.

3-rasm. Benzilpenitsillinning penitsillinamidaza bilan gidrolizi maksimal tezligining rN-bog‘liqligi.
a-nativ ferment; fermentning polikation bilan (b) va polianion (a) bilan kompleksi
Fermentlar atrof-muhitda deyarli doim uchraydigan mikroorganizmlarning “eb bitirishi” xavfi bilan zararlangan. Bundan fermentga mikrog‘ovakli tashuvchilarni biriktirish orqali ekranlash bilan qutulish mumkin. Natijada fermentning tashuvchi bilan bog‘lanishi shuningdek, turli ferment-fermentli bog‘lanish tipidagi polimolekulyar inaktivatsion jarayonlar, agregatsiya yoki proteolitik fermentlar bo‘lgan paytdagi avtoliz jarayoni imkonsiz bo‘lib qoladi (yoki qiyin kechadi). Fermentlar inaktivatsiyasi tarqalishning boshqa g‘oyat keng tarqalgan mexanizmi ularning tashqi muhit noqulay sharoitlaridagi (yuqori harorat, rN ning so‘nggi qiymatlarida, organik erituvchilarda) denaturatsiyasi hisoblanadi. Ferment molekulalarining denaturatsion aylanishini katalitik aktiv konformatsiyani sun’iy mahkamlash orqali to‘sib qo‘yish mumkin. O‘zini oqlagan bir qancha printsiplarning g‘oyalari 4-rasmda keltirilgan, oqsil molekulasining fazoviy tuzilishiga halqalar kiritilganda yanada barqarorligi ortadi (oqsillarni bifunktsional reagentlar bilan ichkimolekulyar “tikish” orqali 4a-rasmga qarang), fermentni tashuvchiga kovalent yoki nokovalent birlatirish natijasida (4b-rasm), yoki uni tashuvchining “tor” poralariga mexanik kiritilishida (4v-rasm). Shu yo‘l bilan oqsil denaturatsiyasini (inaktivatsiya) bir necha yuz, ming, million marta sekinlatish mumkin (stabilizatsiya metodi va ferment tabiatiga bog‘liq ravishda). Bu shuni anglatadiki, masalan, 500S haroratdagi ferment darhol inaktivlanadi (5-rasm), 800S da soatlab yoki sutkalab va past haroratlarda-oylab ishlashi mumkin. Shuningdek, tarkibida suv kam bo‘lgan organik erituvchilarda fermentlarni qanday qilib “majburlab” ishlatish masalasi ham hal etilgan. Shu maqsadda ikki fazali sistemalar suv-suv bilan aralashmaydigan organik erituvchidan foydalaniladi. Geterogen reaktsion muhitni odatda fermentning organik muhitdagi suvli eritmasi mikroemulьsiya singari yoki, metodik va texnologik jihatdan yanada qulay fermentning suvli eritmasi bilan to‘yintirilgan oranik fazadagi (shisha, keramika va boshqalar.) g‘ovaksimon birliklarning suspenziyalari ko‘rinishida hosil qilishadi. Bunday reaktsion muhitning muhim keng tarqalgani – organik erituvchidagi suvning kolloid eritmasidir. Bu erda ferment, sirt aktiv moddaning (detergent, lipid) mitsellasiga bog‘langan holda bir necha yuz yoki ming suv moleklalarini tutuvchi o‘ziga xos mikroreaktorda harakat qiladi (6b-rasm).



4-rasm. Ferment globulalari strukturasini mustahkamlashga yordam beruvchi fizik-kimyoviy printsiplar.
a-ichkimolekulyar “tikish”; b-tashuvchiga kovalent yoki nokovalent birlashish; v-tashuvchining “tor” poralariga mexanik ulanish
5-rasm. Nisbiy katalitik faollikning haroratga bog‘liqligi.
1-Sopolimerlanish usulida poliakrilamid gelida immobillangan ximotripsin (2-rasmga qarang); 2-erkin ferment.
6-rasm. “Suv – suv bilan aralashmaydigan organik erituvchi” qo‘shfazali sistemasi. Tashuvchining porasiga kiritilgan ferment bilan (a) va sirt-aktiv moddaning organik erituvchidagi mitsellarlariga fermentning ulanishi (b)

Fermentlar stabillanishining ilmiy asoslari yaratilishi bilan boshqa, ularning ish faoliyatining uzaytirilishi, denaturirlangan fermentlarning qayta aktivlanishi va kofaktorlarning regeneratsiyasi bilan bog‘liq muammolar ham hozirgi kunda o‘z echimini topib bormoqda. Immobillangan fermentlarni qo‘llashning asosiy sohalari. Immobillangan fermentlar asosan organik sintez, analizga, tibbiyotga, energiyaning konversiya jarayonlariga, oziq-ovqat va farmatsevtika sanoatiga o‘z hissasini qo‘shmoqda. Organik sintez. Fermentlarning organik sintezdagi qo‘llanilishi birinchidan, ko‘pgina organik reagentlar xuddi fermentativ reaktsiyalarning klassik muhitidek suv muhitida yomon eriydi yoki umuman erimaydi. Qo‘shfazali metodning ilmiy asoslanishi fermentativ sintezning rivojlanishida muhim stimul bo‘lib xizmat qildi (6-rasm). Sintetik organik kimyo uchun fermentning ikki fazali reaktsion muhitlaridagi katalitik aktivligini hatto suvning juda kam (foiz miqdorini) miqdorida ham saqlaydi va demak, katalizlanuvchi reaktsiyaning muvozanatini (mahsulotning chiqishini) tadqiqotchi kerakli organik erituvchini tanlagan holda katta diapozonda nazorat qilishi mumkin.

Immobillangan fermentlar ko‘p komponentli organik birikmalar (ba’zi holatlarda noorganik) sistemalarining “reagentsiz” o‘zgarmas analizi uchun yangi metodlarini yaratilishiga turtki berdi. Bu metodlarning asosiy qatori - “fermentli elektrodlar” va “fermentli termistorlar”dir. Kelajakda atrof-muhitni nazorat qilishda va klinik diagnostikada biolyuminestsent analiz hamda immunoferment analizi kabi metodlar muhim o‘rinni egallaydi.

7-rasm. Fermentning fotoimmobillanish sxemasi.

8-rasm. Fruktoza va alkin-oksidlarini birgalikda olishning texnologik jarayonlari.

Energiya va massaning biokonversiyasi. Bu masalalarni avvalo, mikrobiologik yo‘l bilan hal qilinadi. Immobillangan fermentlar suvning fotolizi va bioelektrolizini amalga oshirishda va yoqilg‘i elementlarini real holatda yaratilishida sezilarli hissasini qo‘shib kelmoqda.

Kuchsiz signallarning sun’iy fermentativ kuchaytirgichlari. Immobillangan fermentning faol markaziga tashuvchi orqali, ulьtratovushli qayta ishlash va fotokimyoviy aylanishlar yordamida ta’sir qilish mumkin. Bu ferment-tashuvchi sistemaning katalitik aktivligini mexanik, ulьtratovush va yorug‘lik signallari ta’sirida boshqarishga imkon beradi. Shuning asnosida mexano- va ovoz sezuvchi datchik qurilmalari yaratildi va kumushsiz fotografiyaga keng yo‘l ochildi.
Fermentlarni immobillash metodi yordamida tasvirlarni olish g‘oyasi juda ham oddiy (7-rasm). Dastlabki tashuvchining funktsional guruhlari ferment bilan bog‘lanmasligi lozim, birgina, yorug‘likning ta’siri ostida ular fragmentlarni hosil bo‘lishi bilan borishi (K-»X) natijasida fermentni kimyoviy biriktirib olish xususiyatini paydo qiluvchi kimyoviy aylanishlariga bardosh beradi.
Shunday qilib, yorug‘lik tushgan qismlarda ferment immobillangan ko‘rinishga kiradi, yoritilmagan joylarida esa bu amalga oshmaydi.
Boshqacha aytganda, fermentning fotoimmobillanishi natijasida “yashirin tasvir” paydo bo‘ladi. “Tikilgan” fermentni yorug‘lik ta’sirida bo‘yalgan mahsulotga aylanuvchi substrat eritmasi bilan taglikni qayta ishlab vizualizatsilash mumkin. Umuman, substratli taglikning paydo bo‘lishida har bir fotoimmobillangan ferment molekulasi millionlab bo‘yalgan mahsulot molekulalarini (birlamchi signali kuchayishining katalitik effekti) to‘playdi, shu sabab, yashirin tasvirni oddiy ko‘z bilan ko‘rish mumkin bo‘lib qoladi. Boshqa fermentativ fotografik jarayonlardan farqli ravishda, fotoimmobillash metodi uni aniqlash ferment tabiatiga bog‘liq bo‘lmasligiga qaramay universal hisoblanadi.
Sanoatga oid jarayonlar. Immobillangan fermentlarga asoslangan texnologik jarayonlar birinchi navbatda oziq-ovqat va farmatsevtika sanoatiga kiritilgan. Bu erda biz aytib o‘tmoqchi bo‘lgan asosiy g‘oya shundan iboratki, biokataliz oziq-ovqat va organosintetik texnologiyalar orasidagi birlamchi chegaralarini o‘chirib tashlashdan boshlaydi. Yaqqol misol - AQShda “CETUS Corporation” firmasi ishlab chiqaruvi fruktoza va alken oksidlarining olinish jarayoni (8-rasm). Birinchi bosqichda immobillangan piranozo-2-oksidaza ta’sirida D-glyukoza D-glyukozongacha oksidlanadi; ikkinchi bosqichda palladiy katalizatoridagi vodorod ta’siri ostida olingan glyukoza bilan D-fruktozagacha qaytariladi. Birinchi bosqichning qo‘shimcha mahsuloti (vodorod peroksidi) D etilen yoki propilenning tegishli epoksidlargacha mikrobiologik oksidlanishiga sarflanadi. Ko‘rinib turibdiki, bu jarayonda uchta sintetik metod birlashtirilgan: fermentativ (1 bosqich), kimyoviy (2 bosqich) va mikrobiologik (3 bosqich). Bu jarayonni yarmi ozuqaviy (fruktoza), yarmi organosintetik (epoksidlar), shuning uchun uni takomillashgan, kompleks va chiqindisiz biotexnologiya deb atash mumkin.
Immobillangan fermentlarning tibbiyotda va farmatsevtika sanoatida qo‘llanilishi. Zamonaviy biotexnologiya – bu moddalarning o‘zgarishi va aylanishi biologik jarayonlar yordamida kechadigan kimyodir. O‘tkir raqobat ostida ikki ximiya muvafaqqiyatli rivojlanmoqda: sintetik va biologik. Sintetik kimyo atomlarni o‘rnini almashtirgan, molekulalarni yaratgan, yangi moddalarni yaratgan holda biz uchun birlamchi va zarur bo‘lgan yangi dunyo bilan o‘rab oldi. Bu – dori, yuvish vositalari va bo‘yoqlar, tsement, beton va qog‘oz, sintetik gazlamalar, plastinka va qimmatbaho toshlar, atir va sun’iy olmoslar. Lekin, “ikkinchi tabiat” mahsulotlarini olish uchun qat’iy sharoitlar va spetsifik katalizatorlar zarur. Masalan, mustahkam sanoat qurilmalarida azotning bog‘lanishi yuqori harorat va katta bosim ostida sodir bo‘ladi.
Bunda havoga tutun uyurmalari, ariqlarga esa oqava suvlarining oqimi tashlanadi. Azot to‘plovchi bakteriyalar uchun bu umuman talab etilmaydi. Ularning enzimlaridagi ko‘rsatmalariga asosan, bu reaktsiyalar chiqindi ajratilmasdan toza holda yaxshi sharoitlarda amalga oshiriladi. Lekin, insonning “ikkinchi tabiat” ga yaqinlashishi uni allergiya va turli boshqa xavflar o‘rab olishiga olib keldi. Shuning uchun ona tabiatga yaqinroq tursak yomon bo‘lmasdi. Agarda mikrob oqillaridan sun’iy to‘qimalar tayyorlasakda, dori vositalarini qabul qilsakda hamasidan ham oldinorganizmda ishlab chiqariladiganlaridan qabul qilish lozim.
Mana shu erdan biotexnologiyaning tirik hujayralardan (ma’lum kimyoviy reaktsiyalarda katalizatorlar vazifasini bajaruvchi bakteriya sifatidagi achitqi zamburug‘lari va alohida enzimlar kabi mikroorganizmlar) foydalanuvchi farmatsevtik sanoatining qo‘llanilishi va rivojlanish perspektivalari namoyon bo‘ladi. Noyob tanlovchanlikka ega bo‘lgan enzimlar birgina yagona reaktsiyani amalga oshiradi va chiqindisiz toza mahsulot olish imkoniyatini beradi.
Fermentlar o‘zining noyob xususiyatlarini (effektivligini, tanlovchanligini) hujayra tashqarisida ham saqlaydi. Kimyoviy katalizatorlarga qaraganda fermentlar zaharli emas, ularning sanoaatda qo‘llanilishi iqtisodiy va ekologik nuqtai nazaridan qulay hisoblanadi. Sanoat hajmiga ko‘ra fermentlar aminokislotalar va antibiotiklardan keyin uchinchi o‘rinni egallaydi va to‘qimachilik, teri, tsellyuloza-qog‘oz sanoati, tibbiy, kimyo sanoatida qo‘llanilmoqda. Turli sinf fermentlari atrof-muhitga tushuvchi antropogen organik birikmalarni buzish va o‘zgartirish uchun ishlatiladi.
Fermentlarning tibbiyotda qo‘llanilishi. Proteolitik fermentlar (amilaza, lipaza) oshqozon-ichak, jigar va oshqozon osti bezi trakti kasalliklarida qo‘llaniladi. Oxirgi yillarda proteinazaning o‘sma hujayralarni davolashda qo‘llanilish effektivligi ko‘rsatildi. Proteolitik fermentlar (plazmin va boshq.) qon tomirlaridagi tromblarning eritilishi uchun ishlatiladi. Kollagenaza chandiqlar hosil bo‘lishini tarqatishda, elastaza esa ateroskleroz rivojlanishini to‘xtatish uchun qo‘llaniladi. Fermentlar diagnostik maqsadlarda, masalan, miokard infarktini yoki jigar kasalliklari tushuntirish uchun ishlatiladi.
Immobillangan fermentlar tibbiyotda, birinchidan, past darajadagi zaharli va allergik ta’sirga ega dori vositalarini yaratish uchun yo‘l ochdi. Dunyodagi birinchi immobillangan ferment preparati (streptokinaza) qon-tomir kasalliklarida parentinalь kiritish uchun yaratildi. Ikkinchidan, immobillizatsion yondashuvlar organizmga dorilarning yo‘naltirilgan transporti muammolarini echadi. Fermentlar immobillanishi va ularning sanoatda qo‘llanilishiga misol sifatida alanini aminokislotasi va modelь sistemalardagi koferment regeneratsiyasi (NAD) olishning o‘zgarmas jarayonlari sxemasini keltiramiz. Bu sistemada dastlabki substrat (sut kislota) dekstran NAD va ikkita NADga bog‘liq degidrogenazalarda: laktat va alanindegidrogenazada immobillangan kamera-reaktorga nasos yordamida beriladi; reaktorning qarama-qarshi tomonida reaktsiyaning mahsuloti –alanin berilgan tezlikda ulьtra-filьtratsiya metodi asosida yo‘qotiladi.
Bu turdagi reaktorlar farmetsevtika sanoatida, masalan, gidrokartizon antirevmatoiddan prednizolon preparatini sintez qilishda qo‘llanilidi. Bundan tashqari, ular almashinmaydigan omillarni olishda va sintez maqsadida modelь sifatida ishlatishga xizmat qiladi. Immobillangan fermentlar va kofermentlar yordamida bog‘langan kimyoviy reaktsiyalarni (almashinmaydigan metobolitlar biosintezini hisobga olgan holda) yo‘naltirilganlik asosida amalga oshirish mumkin. Shu asnoda, yangi metodologik yondashuvlar yordamida fan “sintetik biokimyo” sohasiga o‘zining birinchi qadamlarini qo‘ymoqda.
Tadqiqotlarning yangi muhim yo‘nalishlari bo‘lib hujayraning immobillanishi va genotexnika metodlari (gen muhandisligi bo‘yicha loyihalash) asosida mikroorganizmlarinng sanoat shtammlari – vitaminlar va almashinmaydigan aminokislotalarning produtsentlarini yaratish hisoblanadi. Biotexnologiya yutuqlarining tibbiyotda qo‘llanishiga misol sifatida biologik suyuqliklar yoki to‘qima ekstraktlaridagi tireotrop gormonini aniqlash uchun qalqonsimon bez hujayrasining immobillashni keltirish mumkin. Navbatdagi vazifa – kaloriyasiz shirinliklar, jumladan, yuqori kaloriyaga ega bo‘lmagan, shirinligini his qilish mumkin bo‘lgan shakarning ozuqaviy o‘rindoshlarini olishning biotexnologik usulini yaratishdir. Shunday istiqbolli moddalardan biri tarkibida dipeptid metil efiri – aspartilfenilalanin tutgan aspartam hisoblanadi. Aspartam shakardan ko‘ra 300 marta shirinroq, zararsiz va organizmda uchraydigan tabiiy erkin aminokislotalar: asparagin kislota (aspartat) va fenilalanin ko‘rinishida tarqaladi. Aspartam, shubhasiz, tibbiyotda ham, oziq-ovqat sanoatida ham keng qo‘llanilish sohasiga ega bo‘ladi (masalan, AQShda uni bolalar ozuqasida ishlatiladi va dietik koka-kola tarkibiga shakar o‘rnida qo‘shiladi). Genotexnika metodlari asosida aspartamni ishlab chiqarish uchun faqatgina erkin asparagin kislotasi va fenilalaninni emas, balki bu dipeptidning biosintezini katalizlovchi bakterial fermentni ham olish zarurdir.