Hisoblashning ochiq ramkasini izlash

2.3. Noma'lum gen tomonidan kodlangan oqsilning faolligini batafsilroq o'rganish.

Gen inaktivatsiyasi va haddan tashqari ekspressiya genom tadqiqotchilari tomonidan yangi gen funktsiyasini aniqlash uchun qo'llaniladigan asosiy usullardir, ammo bu gen faolligi haqida ma'lumot beradigan yagona protsedura emas. Boshqa usullar inaktivatsiya va haddan tashqari ifodalash natijalarini kengaytirishi va ishlab chiqishi mumkin. Ular gen funktsiyasini aniqlashga yordam beradigan qo'shimcha ma'lumotlarni taqdim etish uchun ishlatilishi mumkin yoki geni allaqachon tavsiflangan oqsil faolligini yanada kengroq tekshirish uchun asos bo'lishi mumkin.

Yo'naltirilgan mutagenez gen funktsiyasini batafsil tekshirish uchun ishlatilishi mumkin

Inaktivatsiya va haddan tashqari ekspressiya genning umumiy funktsiyasini aniqlashi mumkin, ammo ular gen tomonidan kodlangan oqsilning faolligi haqida batafsil ma'lumot bera olmaydi. Misol uchun, genning bir qismi o'z oqsil mahsulotini hujayradagi ma'lum bir bo'linmaga yo'naltiradigan aminokislotalar ketma-ketligini kodlaydi yoki oqsilning kimyoviy yoki fizik signalga javob berish qobiliyatiga javob beradi deb taxmin qilish mumkin.Ushbu gipotezalarni sinab ko'rish uchun genlar ketma-ketligining tegishli qismini yo'q qilish yoki o'zgartirish kerak bo'ladi, ammo oqsil hali ham sintez qilinib, faolligining asosiy qismini saqlab qolishi uchun asosiy qismini o'zgartirilmagan holda qoldirish kerak. Turli xil protseduralar saytga qaratilgan yoki in vitro mutagenez (7.1 Texnik eslatma) bu nozik o'zgarishlarni amalga oshirish uchun ishlatilishi mumkin. Bular muhim usullar bo'lib, ularning qo'llanilishi nafaqat gen faolligini o'rganish, balki oqsil muhandisligi sohasida ham yotadi, bu erda maqsad sanoat yoki klinik sharoitlarda foydalanish uchun yaxshiroq bo'lgan xususiyatlarga ega yangi oqsillarni yaratishdir.
Mutagenezdan so'ng gen ketma-ketligi xost hujayralariga kiritilishi kerak, shunda gomologik rekombinatsiya genning mavjud nusxasini o'zgartirilgan versiya bilan almashtirishi mumkin. Bu muammo tug'diradi, chunki biz qaysi hujayralar gomologik rekombinatsiyaga uchraganligini bilish usuliga ega bo'lishimiz kerak. Hatto xamirturush bilan ham bu umumiy miqdorning faqat bir qismi bo'ladi va sichqonlarda bu qism juda kichik bo'ladi. Odatda biz bu muammoni mutatsiyaga uchragan genning yoniga marker genini (masalan, antibiotiklarga chidamliligini kodlovchi bitta) qo'yish va ushbu marker tomonidan berilgan fenotipni qabul qiluvchi hujayralarni izlash orqali hal qilamiz. Ko'pgina hollarda, marker genini o'z genomiga kiritadigan hujayralar, shuningdek, yaqindan bog'langan mutatsiyaga uchragan genni ham kiritadi va biz xohlaganlar ham shunday. Muammo shundaki, saytga yo'naltirilgan mutagenez tajribasida biz o'rganilayotgan genning faolligidagi har qanday o'zgarish uning muhitini o'zgartirishning bilvosita natijasi emas, balki genga kiritilgan o'ziga xos mutatsiya natijasi ekanligiga ishonch hosil qilishimiz kerak. uning yoniga marker genini kiritish orqali genom. Javob murakkabroq ikki bosqichli genlarni almashtirishdan foydalanishdir (7.19-rasm). Ushbu protsedurada maqsadli gen birinchi navbatda marker geni bilan almashtiriladi, bu rekombinatsiya sodir bo'ladigan hujayralar marker gen fenotipini tanlash orqali aniqlanadi. Keyinchalik bu hujayralar genni almashtirishning ikkinchi bosqichida, marker geni mutatsiyaga uchragan gen bilan almashtirilganda ishlatiladi, muvaffaqiyat endi marker gen fenotipini yo'qotgan hujayralarni izlash orqali nazorat qilinadi. Bu hujayralar mutatsiyaga uchragan genni o'z ichiga oladi va ularning fenotiplari yo'naltirilgan mutatsiyaning oqsil mahsuloti faoliyatiga ta'sirini aniqlash uchun tekshirilishi mumkin.