Gost 8963-73 Ichimlik suvi. Sanitariya va bakteriologik tahlil usullari

3. TAHlil qilishga tayyorgarlik


3.1. Kerakli jihoz va materiallar.
3.1.1. Barcha bakteriologik idishlarni sterilizatsiya qilishdan oldin yaxshilab yuvib quritilishi kerak. 3.1.2. Sinov naychalari va shishalari paxta tiqinlari bilan tiqilib, qog'ozga o'ralgan bo'lishi kerak. Shishalarning bo'yinlariga siz shnur (ip) bilan bog'langan paketning qog'oz qopqog'ini qo'yishingiz kerak.
3.1.3. Namuna olish uchun idishlar qog'oz qopqoq bilan jihozlangan paxta tiqinlari bilan tiqilib qolishi kerak. Qog'ozga o'ralgan, yaxshi tanlangan lapped, kauchuk yoki mantar tiqinlari shishaning bo'yniga bog'langan.
3.1.4. Sinov naychalari va flakonlari uchun tiqinlar paxtadan yasalgan, doka qatlami bilan o'ralgan va bo'sh uchida ip bilan bog'langan.
3.1.5. Petri idishlari metall kassalarga solinadi yoki qog'ozga o'raladi. Bakteriologik idishlarning qopqog'i va pastki qismi o'rtasida (*Rossiya Federatsiyasi hududida GOST R 51652-2000 amal qiladi).
Endo muhitini quyish uchun stakan diametridan 1-2 sm kattaroq filtr qog'ozi doiralarini yotqizishingiz mumkin.
3.1.6. Paxta momig'ining bir qismi pipetkaning oxiriga qo'yiladi, u og'ziga olinadi. Pipetkalar metall qutilarga 6-10 donadan ko'p bo'lmagan holda joylashtiriladi. har birida yoki qog'ozga o'ralgan.
3.2. Idishlarni sterilizatsiya qilish.
3.2.1. Tayyorlangan idishlar (160 ± 5) ° C haroratda pechda 1 soat davomida quruq issiqlik bilan sterilizatsiya qilinadi va shu haroratga yetgan paytdan boshlab sanab chiqiladi. Kauchuk tiqinlari bo'lgan flakonlar avtoklavda (126 ± 2) ° C (1,47 * 105 Pa) 30 minut davomida alohida sterilizatsiya qilinadi.
(O'zgartirilgan nashr, 2-sonli o'zgartirish).
3.2.2. Sterilizatsiya qilingan idishlar 60 ° C dan pastroq soviganidan keyin quritish shkafidan olinadi.
3.2.3. Steril shisha idishlar mahkam yopiq shkaflarda yoki laboratoriya dastgohi qutilarida saqlanadi.
3.2.4. Quritish shkafi bo'lmasa, idishlar 30 daqiqa davomida (126 ± 2) ° C (1,47 105 Pa) avtoklavda sterilizatsiya qilinadi.
(O'zgartirilgan nashr, 2-sonli o'zgartirish).
3.3. Reaktiv va jihozlarni tayyorlash.
3.3.1. Steril suvni tayyorlash
Vodoprovod (quduq, daryo) suvi sinov naychalariga quyiladi
Har birida 10 sm3 yoki har birida 100 sm3 flakonlarda, paxta tiqinlari bilan yopiladi va avtoklavda (120 ± 2) ° S (1.078 * 105 Pa) da 20 daqiqa davomida sterilizatsiya qilinadi. Yaroqlilik muddati ikki haftadan oshmaydi.
Shishadagi suvni sterilizatsiya qilib, ekishdan oldin sterilizatsiya qoidalariga rioya qilgan holda 9 sm3 probirkalarga quyish maqsadga muvofiqdir.
3.3.2. Go'sht suvini tayyorlash
Yog'siz va tendonsiz 500 g maydalangan go'sht 1 dm3 distillangan suvga quyiladi, sovuqda 12 soat yoki 50-60 ° S haroratda suv hammomida 1 soat davomida quyiladi. Keyin infuziya qaynatiladi, doka yoki paxta tolasi orqali filtrlanadi va yana distillangan suv bilan 1 dm3 ga keltiriladi, flakonlarga quyiladi, avtoklavda (120 ± 2) °C (1.078 * 105 Pa) da 20 minut sterilizatsiya qilinadi yoki to'g'ridan-to'g'ri davom ettiriladi. go'shtli bulonni yoki boshqa oziqlantiruvchi vositalarni tayyorlashga.
3.3.3. Mezopatamiya bulonini pishirish
1 dm3 go'shtli suvga 10 g pepton va 5 g natriy xlorid qo'shiladi, pepton va tuz to'liq erimaguncha qizdiriladi, pH (7.2-7.4) o'rnatiladi, tiniqlanadi, filtrlanadi va probirkalarga yoki flakonlarga zarur miqdorda quyiladi. paxta tiqinlari bilan yopilgan va 20 daqiqa davomida (120 ± 2) °C (1.078 * 105 Pa) avtoklavda tahlil sterilizatsiya qilinadi.
ESLATMA. Ruxsat etilgan tortish xatosi 0,1%.
3.3.4. Mezopatamiya agarini tayyorlash
1 dm3 mezopatamiya buloniga 15 gr toladagi yoki kukundagi agar qo'shiladi, to'liq eritmaguncha qizdiriladi, pH (7.2-7.4) tekshiriladi, rangsizlantiriladi, paxta-dokali filtr orqali issiqligida filtrlanadi va flakonlarga yoki probirkalarga tahlilga yetarli miqdorda qo’yiladi. Avtoklavda (120 ± 2) ° S (1.078 105 Pa) da 20 min sterilizatsiya qilinadi.
GOST 18963 -73 C. 6
Mesopatamiya bulonining o'rniga, shuningdek, amin azot konsentratsiyasi kamida 100 mg / dm3 bo'lgan Hottingerning hazm qilishidan foydalaniladi.
3.3.1-3.3.4. (O'zgartirilgan nashr, 2-sonli o'zgartirish).
3.3.5. Dog'iston Oziqlantiruvchi vositalar ilmiy-tadqiqot institutida ozuqaviy agarni tayyorlash
Yorliqda belgilanganidek tayyorlanadi.
3.3.6. Glyukoza-pepton muhitini tayyorlash
Mediya ikki turda tayyorlanadi: normal va konsentrlangan.
Oddiy konsentratsiya muhiti: 10 g pepton, 5 g natriy xlorid, 5 g glyukoza, 1 dm3 distillangan suv. Ko'rsatilgan ingredientlarni eritib bo'lgandan so'ng, indikatorni qo'shing (bromotemol ko'kning 1,6% spirtli eritmasidan 2 sm3 yoki Andrede indikatorining 10 sm3), pH qiymatini (7,4-7,6) o'rnating, suzuvchi yoki paxta parchalari bo'lgan trubalarga 10 sm3 quying. , avtoklavda 112 ° C da (0,49-105 Pa) 12 daqiqa davomida sterilizatsiya qilingan. Konsentrlangan muhitni tayyorlashda suvdan tashqari barcha ingredientlar miqdori 10 baravar oshiriladi.
(O'zgartirilgan nashr, 2-sonli o'zgartirish).
3.3.7. Laktoza-pepton muhitini tayyorlash
Glyukozani laktoza bilan almashtirib, glyukoza-pepton muhiti kabi tayyorlang. 3.3.8. Andrede indikatorini tayyorlash
1 g kislotali fuksin normal natriy gidroksid eritmasida 32 sm3 eritiladi, 200 sm3 distillangan suv qo'shiladi, 37 ° C da 24 soat davomida quyiladi, suziladi, 100 ° C da 5 daqiqa sterilizatsiya qilinadi. Tuproqli tiqin bilan qorong'i shisha butilkada saqlang.
3.3.9. BP indikatori va glyukoza bilan yarim suyuq muhitni tayyorlash Yorliqda belgilanganidek tayyorlang. Yaroqlilik muddati - 7 kundan ortiq emas.
3.3.10. Glyukoza bilan yarim suyuq muhitni tayyorlash
Quruq muhit bo'lmaganda yarim suyuq muhit ishlatiladi. Buning uchun 1 g dm3 distillangan suvda 10 g pepton, 5 g natriy xlorid, 4-5 g agar-agarni eritib, qaynatib oling, pH qiymatini (7.2-7.4) o'rnating, 1,6 ga 1 sm3 qo'shing. bromotimol ko'kning% spirtli eritmasi. 20 daqiqa davomida (120 ± 2) ° C (1,078 105 Pa) da sterilizatsiya qilingan. Eritilgan muhitga 5 g glyukoza qo'shiladi, qaynab turgan joygacha isitiladi, sterjen probirkalarga taxminan 3 sm balandlikdagi kolonnaga quyiladi va 12 daqiqa davomida 112 ° C (0,49-105 Pa) da sterilizatsiya qilinadi. Saqlash muddati 7 kundan ortiq emas.
(O'zgartirilgan nashr, 2-sonli o'zgartirish).
3.3.11. Endo muhitini tayyorlash (modifikatsiya) Yorliqdagi retsept bo'yicha quruq preparatdan tayyorlang.
Stakanlarga quyishdan oldin tayyor va 60-70 °C gacha sovutilgan muhitga 100 sm3 muhitga qo'shilishi mumkin: muhitning farqlovchi xususiyatlarini oshirish uchun 0,2 sm3 asosiy fuksinning 10% spirtli eritmasi va Ekinlarning sporali aerob bakteriyalar bilan ko'payib ketishiga yo'l qo'ymaslik uchun 0,2 sm3 rosolik kislotaning 5% spirtli eritmasidan. Yaxshilab aralashtirilgandan so'ng, vosita 20-25 sm3 stakanlarga quyiladi. Agar muhit yuzasida namlik izlari ko'rinadigan bo'lsa, urug'larri ekishdan oldin idishlarni quriting. Buning uchun steril doiralar bilan yopilgan filtr qog'ozi bilan qotish va quritish uchun stakanlarni 0,5-1 soat davomida vosita bilan qoldirishingiz mumkin. Stakanlarni ikki-uch kundan ortiq bo'lmagan holda qorong’ida yoki muzlatkichda saqlash kerak. Fuxsin va rozolik kislota eritmalarining yaroqlilik muddati bir oydan oshmaydi.
3.3.12. Brilliant Green bilan safro laktoza bulonini tayyorlash
10 g pepton, 10 g laktoza, qoramolning 200 sm3 yangi filtrlangan safroi (yoki distillangan suvda 200 sm3 eritilgan 20 g quruq suvsizlangan safro) eritilib, 700 sm3 distillangan suvda isitiladi, pH qiymati o'rnatiladi ( 7.2-7, 4), porloq yashil rangdagi 1% suvli eritmasidan 13,3 sm3 qo'shing, distillangan suvni umumiy hajmiga 1 dm3 qo'shing, paxta filtri orqali filtrlang, suzuvchi quvurlar ichiga 5 sm3 quying va 112 ° C da sterilizatsiya qiling. (0,49- 105 Pa) 12 daqiqa davomida yoki uch kun davomida 100 ° C da. Yaroqlilik muddati ikki haftadan oshmaydi.
3.3.13. Borik kislotasining bufer muhitini laktoza bilan tayyorlash.
1 g dm3 distillangan suvda 10 g pepton, 12,2 g almashtirilgan kaliy fosfat (suvsiz), 4,1 g bir marta almashtirilgan kaliy fosfat (suvsiz), 3,2 g bor kislotasi, 5 g laktoza, suzib yuruvchi naychalarga 5 sm3 quying, 112 ° C da (0,49 105 Pa) 12 daqiqa davomida sterilizatsiya qiling. Yaroqlilik muddati ikki haftadan oshmaydi.
3.3.12, 3.3.13. (O'zgartirilgan nashr, 2-sonli o'zgartirish).
3.3.14. Gram bilan bo'yash uchun reaktivlarni tayyorlash *
Binafsha gentianning karbolik eritmasi quyidagicha tayyorlanadi: 1 g binafsha gentian, 10 sm3 rektifikatsiyalangan etil spirti, 5 g fenol 100 sm3 distillangan suv qo'shib ohakda maydalanadi.
Lyugol eritmasi quyidagicha tayyorlanadi: 300 g kubometr distillangan suvda 1 g yod, 2 g kaliy yodid eritiladi. Qorong'i shisha butilkada saqlang.
Fuchsin Tsilya quyidagicha tayyorlanadi: 1 g asosiy fuksin, 10 sm3 rektifikatsiyalangan etil spirti, 5 g fenol ohakda maydalanadi, 100 sm3 distillangan suv qo'shiladi.
Shisha slayddagi smear uni bruska olovidan uch marta o'tkazib o'rnatiladi. Preparatga filtr qog'ozi tasmasi qo'llaniladi va unga gentian violetning karbolik eritmasi 0,5-1 min davomida quyiladi, qog'oz olinadi, Lyugol eritmasi 0,5-1 min davomida quyiladi, Lyugol eritmasi quyiladi va shisha etanolda 0, 5—1 minut davomida, bo'yoq tark etguncha yuviladi. Keyin stakan suv bilan yaxshilab yuviladi va distillangan suv bilan 1:10 nisbatda aralashtirilgan Tsilya fuchsin bilan 1-2 daqiqagacha bo'yaladi. Preparatni yuvib quritgandan so'ng, smear mikroskop qilinadi.
Gramm bilan bo'yashning ekspres usuli.
1-sonli reaktivni tayyorlash: 0,5% alkogol eritmasi kristal binafsha rang.
2-sonli reaktivni tayyorlash: 0,4 g kaliy yodidi 100 sm3 rektifikatsiyalangan etil spirtida eritiladi, suv hammomida isitiladi yoki xona haroratida bir kunga qoldiriladi. Keyin 0,2 g kristalli yod va 0,1 g asosiy fuksin qo'shing. Qorong'i shisha butilkada saqlang.
* Gentian binafsha va fuxsin Ziehlning karbolik eritmasi o'rniga tegishli eritmalarga namlangan va quritilgan filtr qog'ozi ™ chiziqlaridan foydalanishga ruxsat beriladi.
Bir tomchi distillangan suv (qattiq muhitda koloniyalardan preparatni tayyorlashda) yoki bir tomchi bulon kulturasi spirtli ichimliklar bilan yog'siz shisha slaydga surtiladi. Tahlil qilingan koloniyadan yoki qattiq muhitdagi sof madaniyat maysazoridan oz miqdordagi mikrob hujayralari distillangan suv tomchisiga qo'shiladi. Keyin bir tomchi №1 reaktiv tsikldagi tomchiga kiritiladi, aralash stakan ustiga taqsimlanadi va smear xona haroratida quritiladi. Keyin burner olovga o'rnatiladi, suv bilan yuviladi, filtr qog'ozi bilan quritiladi va №2 reaktiv qo'llaniladi, shu bilan butun shisha yuzasini qoplaydi, 1-5 minut davomida (rasmning davomiyligi uning natijasiga ta'sir qilmaydi) . Preparatni suv bilan yaxshilab va tez yuvib tashlang, filtr qog'ozi bilan quriting va mikroskop bilan yuving.
3.3.15. Bakteriyalarning oksidaz faolligini aniqlash uchun reaktiv tayyorlash
2,5 sm3 rektifikatsiyalangan etil spirtida 30-40 mg a-naftol eritiladi, 7,5 sm3 distillangan suv qo'shiladi va 40-60 mg dimetil-p-fenilendiamin eritiladi. Eritma aniqlanishidan oldin darhol tayyorlanadi.
Oksidaza testi Enterobacteriaceae oilasining bakteriyalarini Pseudomonadaceae oilasining grammusbat bakteriyalaridan farqlash uchun mo'ljallangan va faol oksidaza fermentiga ega bo'lgan va fenilendiamin birikmalarini yorqin ko'k indofenolga oksidlovchi boshqa suv saprofitik bakteriyalari.
3.3.15.1. Membranali filtrlar usuli bilan ishlashda oksidaz sinovini shakllantirish
Unda o'stirilgan bakterial koloniyalar bilan membrana filtri rezin bilan mo'l-ko'l namlangan filtrdan biroz kattaroq diametrli filtr qog'ozi doirasiga pinset bilan uzatiladi. Natija 2-4 daqiqadan so'ng aniqlanadi. Ko'k rangga bo'yalgan yoki ko'k rangli jant bilan barcha koloniyalar Enterobacteriaceae oilasiga tegishli emas, ular hisobga olinadi.
Asl rangini o'zgartirmagan koloniyalarni asosan ichak tayoqchasi guruhining bakteriyalari hosil qiladi, ammo ular orasida sanitariya-indikativ ahamiyatga ega bo'lmagan kokklar, spora hosil qiluvchi va grammusbat tayoqchalar bo'lishi mumkin, ular bundan keyin hisobga olinmaydi. mikroskopiya va (37 ± 0,5) ° S darajasida glyukoza bo'lgan yarim suyuq muhitda gaz hosil bo'lishining yo'qligi. Oksidaza faolligini aniqlash uchun reagentning bakteritsid xususiyatini hisobga olgan holda, reaksiya aniq namoyon bo'lgandan so'ng darhol membrana filtri yana Endo muhitiga o'tkaziladi va darhol (5 daqiqadan kechiktirmasdan) oksidaz-salbiy koloniyalar subkulturaga kiritiladi. glyukoza bilan yarim suyuq muhitga.
3.3.15.2. Fermentatsiya usuli bilan ishlaganda oksidaza sinovini muhitning tarmoqlarida o'stirilgan har bir turdagi 2-3 ta ajratilgan koloniyalar
Endo, ilmoq yoki shisha tayoqcha bilan olib tashlanadi va reaktivga botirilgan filtr qog'oziga chiziladi. Agar oksidaz mesh salbiy bo'lsa bakterial massa qo'llaniladigan joyda qog'oz rangini o'zgartirmaydi, agarda bakteriyalar faol oksidaza bo'lsa, 1 daqiqa ichida ko'k rangga aylanadi.
Izolyatlangan koloniyalar o’rganib chiqish majburiydir, aks holda siz oksidaz-musbat bakteriyalar qo'shilishi sababli soxta ko'k rang o'zgarishi bilan E. coli yo’qotishingiz mumkin. ESLATMA. Agar Endo vositasi bilan oksidaz testi ingibirler aralashganligi sababli aniq ko'rinmasa (bu asosan quyuq qizil koloniyalarga tegishli bo'lsa), unda to'g'ri natijani olish uchun bunday koloniyalar subkulturani tarmoqlarda yoki ozuqaviy aqar moyilida va o'sgandan so'ng, oksidaz sinovini takrorlang.