Genomika asoslari

42- Rasm. Amplifikatorlar


PZR reaktsiyasini o’tkazish.
Asosan PZR da 20-35 sikllar o’tkaziladi, ularning har biri uch bosqichdan iborat.
Denaturatsiya
Ikki zanjirli DNK-matritsa 94-96°C gacha isitiladi yoki agar termostabil polimeraza ishlatilsa, DNK zanjiri ochilishi uchun 98°C haroratda 0,5-2 minut qizdiriladi. Bu bosqich erish harorati denaturatsiya deb ataladi, ushbu jarayonda DNK tarkibidagi vodorod bog’lari ochiladi. Odatda, birinchi bosqichdan oldin reaktsion aralashma 2-5 minut matritsa va praymerlarning to’liq denaturatsiyasi uchun uzoq qizdirish o’tkaziladi.

43-Rasm. Birinchi va ohirgi yo’laklarda DNK markerlarining tasviri, Qolgan yo’laklarda PZR mahsulotlarining tasviri.
Qizdirish.
DNK zanjirlari ochilgan keyin, harorat tushiriladi, bunda parymerlar bir zanjirli matritsa bilan bog’lanadi. Ushbu bosqich kuydirish bosqichi deb ataladi. Kuydirish harorati praymerlar tarkibiga bog’liq bo’lib, praymerlar erish haroratidan 5 gradus past harorat tanlab olinadi. Kuydirish haroratini noto’g’ri tanlash, praymerlarning matritsa bilan noto’g’ri bog’lanishiga- yuqori haroratda, yoki noto’g’ri joyda bog’lanishiga va maxsus bo’lmagan mahsulotlarning hosil bo’lishiga olib keladi- past haroratda. Kuydirish bosqichining vaqt oralig’i- 30 sekundni tashkil qiladi, bir vaqtning o’zida, bu vaqt davomida polimeraza bir necha yuz nukleotidlarni sintez qilishga ulguradi. Shuning uchun 60⁰ va undan yuqori erish haroratiga ega bo’lgan praymerlar tanlab olinadi va kuydirish va elongatsiya bosqichlari bir vaqtda 60-72⁰ da olib boriladi.
Elongatsiya.
DNK-polimeraza matritsa zanjirida replikatsiya o’tkazadi, bunda birlamchi nukleotid sifatida (zatravka) praymer ishlatiladi. Bu bosqichga elogatsiya deb ataladi. Plomeraza ikkinchi zanjir sintezini praymer 3’ ohirgi uchidan boshlaydi, u zanjir bo’ylab matritsa bilan bog’lanadi, va matritsa bo’ylab, yangi zanjirni 5’ uchidan 3’ uchiga qarab suntez qilib boradi. Elongatsiya harorati polimerazaga bog’liq bo’ladi. Ko’p ishlatiladigan Taq va Pfu ploimerazalar 72 ⁰ haroratda faol bo’ladi. Elongatsiya vaqti DNK-polimeraza tipiga bog’liq bo’lib, amplifikatsiya qilinadigan fragment turiga ham bog’liq bo’ladi.Odatda elongatsiya vaqti har bir ming nukleotidga nisbatan bir minutga to’g’ri keladi. Hamma sikllar tugaganidan so’ng, bir zanjirli fragmentlarni ohirigacha qurish maqsadida, qo’shimcha final elongatsiya bosqichi o’tkaziladi. Bu bosqich 7-10 minut davom etadi. Reaktsiya mahsus mhsulotlarining soni nazariy jihatdan proportsional 2ⁿ — 2n songa ko’payadi, bu yerda n- reaktsiya sikllarining sonini anglatadi. Umuman olganda, har bir sikl samarasi 100% dank am bo’lishi mumkin, shuning uchun aniqlikda P ~ (1+E)ⁿ to’g’ri keladi, bu yerda P- mahsulot soni, E- siklning o’rtacha samarasini anglatadi. DNK uzun nusxalarining soni chiziqli ravishda ortadi, shuning uchun reaktsiya mahsulotlarida spetsifik fragment ko’p uchraydi.
Kerakli mahsulotlarning geometrik progressiyasi reagentlat miqdori, ingibitorlar mavjudligi va nojo’ya mahsulotlarning hosil bo’lishi hisibiga chegaralangan. Ohirgi sikllarda reaktsiya o’sishi pasayadi, bu jarayonga “plato samarasi” deb ataladi.