Genomika asoslari

44- Rasm. RZR raektsiyasi uslubi.
PZR variantlari:

• 
  RPA (Recombinase Polymerase Amplification — 
  
• 
  Rekombinazali polimerazali amplifikatsiya — DNK/RNK amplifikatsiyasi 15 minut termosiklersiz o’tkazilganga qo’llaniladi (izptermal reaktsiyada).
  
• 
  Kiritilgan PZR (nested PCR) — Reaktsiya nojo’ya mahsulotlarining kamaytirish maqsadida qo’llaniladi. Bunda, ikkita praymer ishlatiladi va ikkita ketma-ket reaktsiyalar o’tkaziladi. Praymerlar ikkinchi jufti birinchi reaktsiya mahsuloti ichidagi DNK qismlarini amplifikatsiya qiladi.
  
• 
  Invertirlangan PZR- (inverse PCR) — Kerakli nukleotidlarning ichki qismidagi kichik qismlar ma’lum bo’lgandagina ishlatiladi. Bu uslub juda foydali bo’lib, genomga DNK kiritilganda, qo’shni ketma-ketliklarni aniqlashda ishlatiladi. Invetirlangan PZR o’tkazish uchun DNKni restriktazalar bilan kesish va fragmentlarni o’zaro tikish (ligirlash) o’tkazish kerak bo’ladi. Buning natijasida, ikkala noma’lum uchidagi ma’lum fragmentlar joylashadi va PZT o’tkazish imkonini beradi.
  
• 
  Teskari transkriptsiyali PZR- (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) —
  

RNK kutubhonalaridan ma’lum bo’lgan ketma-ketliklarni identifikatsiya, ajratish va amplifikatsiya qilish uchun qo’llaniladi. Oddiy PZR rektsiyasidan oldin iRNK matritsasida revertaza fermenti ishtirokida bir zanjirli DNK sintez qilinadi, va bir zanjirli kDNK hosil qilinadi, bu DNK PZR uchun matritsa vazifasini bajaradi. Bu uslub ma’lum genlarni qachon va qayerda ekpressiyasini aniqlashda ishlatiladi.

• 
  Assimetrik PZR (asymmetric PCR) — ko’proq birlamchi DNK zanjirlarian birini amplifakatsiya qilishda qo’llaniladi. Sekvenirlash va gibridizatsiya tahlillaarining ayrimlarida qo’llaniladi. PZR odatda, praymerlarning biri ko’p qo’llanilganda ishlatiladi. Bu uslubning modifikatsiyasi Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR bo’lib, bunda past konsentrasiyali praymerlar ishlatiladi va past konsentrasiyali praymerlar yuqori haroratda erish haroratiga qarab tanlanadi. PZR yuqori haroratda kuydirish o’tkaziladi, shu bilan hamma sikllar davomida reaktsiya samarasi ta’minlanadi.
  
• 
  Miqdoriy PZR (quantitative PCR, Q-PCR), yoki, real vaqtdagi PZR (real-time polymerase chain reaction), — reaktisiya har bir siklida aniq PZR mahsulotining hosil bo’lish miqdorini to’g’ridan-to’g’ri kuzatish uchun ishlatiladi. Bu uslubda reaktsiya mahsulotlarini yig’ilishini tahlil qilish uchun fluorestsent nishonlangan DNK-zondlari yoki SYBR Green bo’yoqlari ishlatiladi, Sybr Green real vaqtdagi PZR reaktsiyasida PZR mahsulotlarining miqdoriy aniqlash va deteksiyasida ishlatish uchun iqtisodiy jihatdan samarali va oddiy hisoblanadi. Uslubda mahsus fluorestsent zondlari va praymerlar ishlatilmaydi. Amplifikatsiya davomida SYBR Green I bo’yog’i PZR mahsulotlarining DNK kichik (borozdkasiga) bog’lanadi va ko’k lazer nurlarida bog’lanmagan bo’yoqlarga nisbatan kuchli fluorestsent sugnal hosil qiladi. SYBR Green I uchun nur yutish qobilayati maksimumi 494 nmni tashkil qiladi. Bundan tashqari, bo’yoq spektrlarida- ikkita kattaa bo’lmagan qo’shimcha yutish maksimumlari mavjud- 290 nm va 380 nm. SYBR Green I uchun maksimum chiqarish 521 nmda to’lqin uzunligida yashil spektrlarda joylashgan.
  
• 
  Bosqichli PZR (touchdown PCR) — bu uslub yordamida praymerlarning nospetetsifik bog’lanishi ta’sirini kamaytirish amalga oshiriladi. Birinchi sikldni kuydirish bosqichining optimal haroratidan yuqori bo’lgan haroratda o’tkaziladi, keyinchalik bir necha sikl davomida kuydirish bosqichinining optimal haroratiga keltiriladi. Bunday jarayonning o’tkazilishi praymerning butun zanjir bilan komplementar gibridizatsiyasini amalga oshirish uchun zarur bo’ladi, vaholanki kuydirish jarayoni optimal haroratida praymerkomplementar zanjir bilan qisman gibridizatsiyasi amalga oshadi. Genom DNK sida praymer qisman gibridizatsiyasi agar praymer bog’lanishi uchun ko’p joy mavjud bo’lsa, nospetsifik amplifikatsiyaga olib keladi. Ko’p hollarda, PZR birinchi o’nta siklini 72-75 °С kuydirish haroratida o’tkazish mumkin, keyinchalik 60-65°С optimal haroratga tushirish mumkin.
  
• 
  Molekulyar koloniyalar uslubi (geldagi PZR, colony PCR) — akrilamid gelda PZR komponentlarida polimerizatsiya o’tkaziladi, PZR o’tkaziladi. Tahlil qilinayotgan nuqtalardagi DNKning amplifikatsiyasi o’tadi va molekulyar koloniyalar hosil bo’ladi.
  
• 
  kDNK uchlarida tez o’tadigan amplifikatsiya asosidagi PZR- (rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR).
  
• 
  Uzun fragmentlar PZR (long-range PCR) — DNK uzun qismlarining amplifikatsiyasiga modifikatsiya qilingan PZR – 10000 va undan uzun asoslar uchun yaratilgan. Polimerazalar ikki xil aralashmasi ishlatiladi- ularning biri yuqori faollikka ega bo’lgan Taq polimeraza bo’lib, bir o’tishda DNK uzun zanjirini sintezlash qobiliyatiga ega, ikkinchisi- DNK- polimeraza 3’-5’- endonukleaza faolligiga ega bo’lib, bu Pfu polimerazalar turiga kiradi. Ikkinchi polimeraza Taq- polimeraza tomonidan ro’y bergan hatolarni to’g’irlashda ishlatiladi, chunki Taq- polimeraza DNK tarkibida nokomplementar nukleotid paydo bo’lsa, sintezni to’htatadi. Bu komplementar bo’lmagan nukleotidni Pfu- polimeraza olib tashlaydi. Polimerazalar arlashmasi 50:1 nisbatda olinadi, yoki 100:1 ham bo’lishi mumkin, bu yerda Taq- ploimerazalar 25-100 baravar Pfu polimeazaga nisbatan ko’p ishlatiladi.
  
• 
  RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) – polimorf DNK ni
  

tahminan amplifakatsiyasi asoslangan PZR bo’lib, bir- biriga yaqin bo’lgan organizmlar irsiy ketma-ketliklarini aniqlashda ishlatiladi, masalan madaniy o’simliklar turli xil navlari, itlar zoti yoki yaqin qarindosh mikroorganizmlar.
Bu uslubda odatda, katta o’lchamga ega bo’lmagan praymer ishlatiladi, 10 juft nukleotid qatoriga ega bo’lgan. Bu praymer tadqiqot qilinayotgan organism tahminiy qismlaiga qisman komplementar bo’ladi.Sharoitlar praymer uzunligi, uning tarkibi va harorat tanlab olingan holda, ikki xil organism uchun mavjud bo’lgan farqlarni aniqlash mumkin.

• 
  Mahsus guruhli PZR (group-specific PCR) — bir turga yoki turli xil turlar o’rtasidagi qarindosh ketma-ketliklarni konservativ praymerlar orqali aniqlash hisoblanadi. Masalan, ribosomal 18S va 26S genlarga nisbatan universal praymerlar tanlab olinib, ularni turga xos genlararo speyserlarni amplifikatsiya qilish, 18S va 26S ketma-ketliklar turlar o’rtasida konservativ bo’lib, PZR tadqiqot qilinayotgan turlar hammasida bu genlar o’rtasida o’tadi. Bu uslubga qarama- qarshi unikal PZR si (unique PCR), bo’lib, bunda muammo, hamma qaraindosh bitta ketma-ketlik amplifikatsiyasi uchun mahsus praymer tanlab olinadi.
  
• 
  Qaynoq start asosidagi PZR (hot start PCR) — DNK- polimeraza ishlatilagn holatdagi PZR modifikatsiyasi bo’lib, polimeraza faolligi hona haroratida reaktsiya birinchi bosqichigacha, DNK birinchi denaturatsiyasida, antitanalar yordamida bloklanadi yoki bloklash uchun imitatsiya antitanalari Affibody deb ataladigan katta bo’lmagan molekulalar ishlatiladi. Birinchi denaturatsiya asosan odatda, 95 °C haroratda 10 minut davomida o’tkaziladi.
  
• 
  Virtual PZR (in silico PCR, raqamli PZR, electron PZR, е-PZR) — praymer yoki DNK zondlarining ketma-ketliklarining ro’yhatidan foydalangan holda, PZR ning nazariy matematik uslubiga yondashgan kompyuter tahlili tadqiqot qilinayotgan genom, xromosoma, halqasimon DNKning yoki DNK hohlagan DNK qismining potentsial DNK amplifikatsiyasi bashorat qilinadi.