agrobakteriya ikki pallali o'simliklarni deyarli barchasini transformatsiyalaydi (hattoki
boshoqli ekinlarni ham);
T-DNK o'simlik genomiga joylashib oladi. Oqibatda T-DNK genlari o'simlikning
keyingi avlodlariga dominant belgi sifatida Mendel' qonunlari bo'yicha irsiylanaveradi.
Transgen o'simlik yaratish uchun Ti-plazmidaning T-DNK qismiga kerakli genlar
kiritilsa bas, qolgan barcha ishni bakteriyani o'zi bajaradi. Biroq recombinant DNK
olish uchun Ti-plazmidaning o'lchami juda katta. Ushbu muammoni hal qilish
maqsadida quyidagi rasmda ko'rsatilgan tehnologiya ishlab chiqilgan.
Ti-plazmidadan vektor sifatida foydalanish. Dastlab Ti-plazmidadan restriktazalar yordamida T-DNK kesib olinadi. Kesib
olingan
T-DNK
E. coli
bakteriyasining
pBR322 plazmidasiga kiritiladi. pBR322 plazmidasidagi T-DNKga o'simlik geni
joylashtiriladi. Gibrid plazmida hosil bo'ladi. Bu plazmida agrobakteriyaga qayta kiritiladi. Agrobakteriya esa o'simlikka
yuboriladi.
Dastlab Ti-plazmidaning T-segmenti restriktazalar bilan kesiladi. T-segmentni
ko'paytirish uchun
Escherichia coli
bakteriyasinngpBR322 plazmidasiga kiritiladi.
pBR322 replikatsiyalanganda undagi T-segmentni soni ham ko'payadi. Bu jarayon
klonlash
deyiladi. Tarkibida T-segment saqlagan pBR322 plazmidasi etarlicha
klonlangandan keyin bakteriyadan ajratiladi. Ajratilgan gibrid plazmidaga o'simlik
geni joylashtiriladi
va yana klonlash uchun
Escherichia coli
bakteriyasiga qayta
kiritiladi. Klonlangan plazmidalar
Escherichia coli
bakteriyasidan ajratiladi va
agrobakteriya sitoplazmasiga kiritiladi. So'ngra agrobakteriya o'simlikka yuboriladi.
Agrobakteriyadagi gibrid plazmidaning T-segmenti o'simlik genomiga qo'shilib ketadi.
Transgen o'simlik ana shunday tehnologiya asosida yaratiladi.
Yuqorida keltirilgan tehnologiyani biroz soddalashtirish mumkin. Buning uchun
binar vektor sistemalardan foydalaniladi. Bunda agrobakteriya hujayrasida ikki hil
modifikatsiyalangan Ti-plazmida bo'lishi kerak. Plazmidalarning biridafaqat
vir-
zona
bo'ladi.
vir-
zona T-DNK kesilishi uchun javobgar. Bunday
plazmidalar yordamchi
plazmidalar deyiladi.
Ikkinchi plazmidada esa faqat o'simlik geni kiritilgan T-DNK bo'ladi.
Ikkala plazmida bitta hujayraga joylashtiriladi. Agrobakteriya ikki hil
plazmidasi bilan birga o'simlikka yuboriladi. Yordamchi plazmidaning vir-zonasi
ikkinchi plazmidaning T-segmentini kesadi. Yuqorida ta'kidlanganidek, T-segment
o'simlik genomiga birikadi.
Qisqa qilib aytganda, Ti-plazmida asosidagi ideal
vektor sistema quyidagi
elementlar va hossalarga ega bo'lishi zarur:
3)
o'simlik genomiga barqaror qo'shilishi uchun barcha kerakli signallar, genlarning
ekpressiya
sistemasi
(o'simlik
polimerazalari
«taniydigan»
promotor),
transformatsiyalangan hujayralarni selektsiyasi (saralash) uchun marker;
4)
vektor sistemada onkogenlar bo'lmasligi kerak. Ular o'simlik hujayralarini
differentsiyallanishini to'htadi.
Onkogenlarni yo'qotish uchun
transpozonli mutagenez
(transpozon - ko'chib
yuruvchi genetik element) usuli qo'llaniladi. T-DNKga
transpozonlar kiritilsa,
o'simlikda
shish hosil qiladigan genlar (
iaaM, iaaH, ipt
) «o'chiriladi». Transpozonlar T-
DNKni o'simlikka o'tishiga halaqit qilmaydi. Transpozonli mutagenezda Tn5, Tn7
bakterial transpozonlardan foydalaniladi.
Ti-plazmidani modifikatsiyalashda restriktsiya saytlariga (restriktazalar kesadigan
uchastkalar) ham e'tibor berish kerak. Modifikatsiyada EcoR1, Hind III, BamH1 va
boshqa restriktazalar ishlatiladi. Ba'zida ma'lum bir saytning 18-20uchastkasidan
taniydigan turli hil restriktazalar bo'ladi. Shuning uchun bunday uchastkalar
polilinkerlar
deb ataladi.
Bundan tashqari, vektor molekulalarini konstruktsiyalashda
promotorlarga ham
e'tibor berish kerak. Promotor quyidagi hossalarga ega bo'lishi kerak:
faol ekspressiya;
to'qima va organspetsifik ekspressiya;
boshqarilish imkoniyati.
Ayrim
genlar
yuqori
temperatura
ta'sirida
faollanadi.
Bunday
genlar
boshqariladigan promotorlarga misol bo'ladi. Ayrim genlar zahira oqsillari (masalan,
boshoqli o'simliklarda uchraydigan zein oqsili) sintezini nazorat qiladi. Ular to'qima
spetsifik ekspressiyaga misol bo'ladi.
O'simliklar gen muhandisligida ko'p ishlatiladigan promotor - CAMV (
cauliflower
mosaic virus
– gulkaram mozaikasi virusi) promotori. CAMV promotoriga ulangan
genlar o'simlikning barcha to'qimalarida faol ekpressiyalanadi.
Va nihoyat vektorlarda markerlar ham bo'lishi zarur. Chunki transgen o'simliklar
marker genlar yordamida saralanadi. Marker genlar reporter genlar ham deyiladi.
Marker genlar soni anchagina. Misol uchun,
luxA
va
luxB
genlari. Ular tunda yonib
turadigan hasharotlar DNKsidan ajratilgan.
luxA
va
luxB
genlari lyutsiferaza
fermenti
sintezini boshqaradi. Lyutsiferaza oksidlangan lyutsefirin pigmentini lyutsefiringa o'tish
reaktsiyasini katalizlaydi. Tungi hasharotlarning yonib turishiga luytsefirin pigmenti
sababchidir.
luxA
va
luxB
marker genlarini saqlagan transgen o'simlikni boshqalaridan
ajratib olish oson. Chunki ular, yuqorda aytganimizdek, chiroq shu'lasi kabi yonib
turadi.
Ohirgi
paytlarda
pgfp
markeri ham keng ishlatilmoqda. Bu genGFP-oqsili (green
fluorescent protein) sintezini nazorat qiladi.
U Acquorea victoria
meduzasining
DNKsidan olingan. Tanasida
pgfp
markeri saqlagan transgen o'simlikka ul'trabinafsha
nur tushurilsa, u yashil rang berib tovlanadi.
T-DNK orqali o'simlik hujayralarini transformatsiyalashning an'anaviy usuli -
mahsus jarohatlangan yosh o'simlik novdasiga tarkibidaTi-plazmida mavjud
agrobakteriyani kiritish. Hozirda transgen o'simlik olishning
bir necha hil usullari
ishlab chiqilgan. Hattoki mahsus «Shotgun» qurilmasi yaratilgan. DNK molekulalari
vol'fram sharchalar bilan o'raladi va «Shotgun» qurilmasida o'simlik tanasiga miltiqdan
o'q otish kabi otiladi.
Do'stlaringiz bilan baham: 
