Аминокислот в белках, пептидах и лекарственных препаратах

Разделение проводят по программе градиентного элюирования с линейным 
изменением состава подвижной фазы от смеси ацетонитрил — метанол — 
ацетатный буферный раствор (10:40:50, об/об/об) до смеси ацетонитрил — 
ацетатный буферный раствор (50:50, об/об). В результате такого элюирования 20 
производных аминокислот разделяются в течение 20 мин. Элюируемые из 
колонки производные аминокислот определяют при длине волны возбуждающего 
света 260 нм и длине волны излучаемого света 313 нм.
Предел обнаружения находится в нижнем фемтомолярном диапазоне. 
Линейность сигнала для большинства аминокислот наблюдается в области 0,1—
50 мкмоль. 
МЕТОД 
8. 
ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ 
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ 
С 
7-ФТОР-4-
НИТРОБЕНЗО-2-ОКСА-1,3-ДИАЗОЛОМ 
Предколоночная дериватизация аминокислот с 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-
1,3-
диазолом (НБД) проводится перед разделением смеси аминокислот методом 
обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.
НБД взаимодействует с первичными и вторичными аминокислотами с 
образованием производных с сильной флуоресценцией. Аминокислоты 
дериватизируются с НБД при нагревании до 60 °С в течение 5 мин.
НБД-производные аминокислот могут быть разделены на колонке, 
заполненной силикагелем октадецилсилильным, методом обращенно-фазовой 
ВЭЖХ с использованием программы градиентного элюирования и подвижной 
фазы, состоящей из ацетонитрила и водной буферной смеси. В результате такого 
элюирования 17 производных аминокислот разделяются в течение 35 мин. В 
качестве внутреннего стандарта может быть использована ε-аминокапроновая 
кислота, которая элюируется в свободной от пиков области хроматограммы. 
Элюируемые из колонки производные аминокислот определяют при длине волны 
возбуждающего света 480 нм и длине волны излучаемого света 530 нм.
Чувствительность этого метода почти такая же, как в предколоночной 
дериватизации с ОФА (метод 5), за исключением пролина, который не реагирует с 
ОФА (преимущественное отличие метода с НБД). Предел обнаружения для 
каждой аминокислоты составляет около 10 фмоль. Анализ проводят с 
использованием 1,5 мг белкового гидролизата в предколоночной реакционной 
смеси. 
РАСЧЕТ И АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ 
При определении содержания аминокислот в белковом/пептидном 
гидролизате следует учитывать, что при кислотном гидролизе триптофан и 
цистеин разрушаются, серин и треонин разрушаются частично, в то время как 
связи по остаткам изолейцина и валина расщепляются не полностью. Метионин 
во время кислотного гидролиза может подвергаться окислению, в результате чего 
появляются свободные аминокислоты (например, глицин и серин), загрязняющие 

---

образец. Использование вакуума (менее 200 мкм ртутного столба, или 26,7 Па) 
или введение инертного газа (аргон) в пространство реакционного сосуда может 
уменьшить степень окислительной деструкции. Поэтому количественные 
результаты, полученные для цистеина, триптофана, треонина, изолейцина, 
валина, метионина, глицина и серина из белкового/пептидного гидролизата, могут 
быть непостоянными и служить основанием для дальнейшего исследования и 
анализа.