Аминокислот в белках, пептидах и лекарственных препаратах



Download 209,86 Kb.
Pdf ko'rish
bet9/13
Sana23.02.2022
Hajmi209,86 Kb.
#161799
1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   13
Bog'liq
2.2.56 Аминокислотный анализ


Разделение ФТК-производных аминокислот методом обращенно-фазовой 
ВЭЖХ на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным достигается 
путем подбора концентрации ацетонитрила и ионной силы буферного раствора. 
Элюируемые из колонки ФТК-производные аминокислот определяют при длине 
волны 254 нм.
Предел обнаружения для большинства ФТК-производных аминокислот 
обычно составляет 1 пмоль. Линейность сигнала наблюдается в области 20—500 
пмоль 
с 
коэффициентом 
корреляции 
более 
0,999. 
Для 
получения 


удовлетворительных данных рекомендуется перед гидролизом использовать 
образцы белка/пептида массой более 500 нг. 
МЕТОД 4. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 6-АМИНОХИНОЛИЛ-
N-
ГИДРОКСИСУКЦИНИ-МИДИЛКАРБАМАТОМ 
Предколоночная дериватизация аминокислот с 6-аминохинолил-N-
гидроксисукцинимидилкарбаматом (АХК) проводится перед разделением смеси 
аминокислот 
методом 
обращенно-фазовой 
ВЭЖХ. 
АХК 
реагирует 
с 
аминокислотами с образованием стабильных флуоресцирующих несимметричных 
производных мочевины (АХК-аминокислот), которые легко поддаются анализу 
методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.
Разделение АХК-производных аминокислот методом обращенно-фазовой 
ВЭЖХ на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным, достигается 
подбором концентрации ацетонитрила и ионной силы буферного раствора. 
Селективное флуоресцентное детектирование производных при длине волны 
возбуждающего света 250 нм и при длине волны излучаемого света 395 нм 
допускает прямой ввод реакционной смеси без каких-либо существенных 
поправок на основной флуоресцирующий побочный продукт — 6-аминохинолин. 
Избыток реактива быстро гидролизуется (t
1/2
< 15 
с) с образованием 6-
аминохинолина, N-гидроксисукцинимида и диоксида углерода, а через 1 мин 
дальнейшее образование производных не происходит.
Площади пиков для АКХ-аминокислот, по существу, не изменяются, по 
меньшей мере, в течение 1 недели хранения растворов при комнатной 
температуре. Следовательно, АХК-аминокислоты обладают более чем 
достаточной стабильностью для проведения круглосуточного автоматического 
хроматографического анализа. Предел обнаружения для каждой аминокислоты, 
кроме цистеина, находится в области от 40 фмоль до 320 фмоль.
Предел обнаружения для цистеина составляет около 800 фмоль. 
Линейность сигнала наблюдается в области 2,5—500 мкмоль с коэффициентом 
корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных данных 
рекомендуется перед гидролизом использовать образцы белка/пептида массой 
более 30 нг. 
МЕТОД 5. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С О-ФТАЛЕВЫМ 
АЛЬДЕГИДОМ 
Предколоночная дериватизация аминокислот с о-фталевым альдегидом 
(ОФА) проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-
фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Метод не позволяет 
определять аминокислоты, являющиеся вторичными аминами (например, 
пролин).
ОФА в присутствии тиольных соединений реагирует с первичной 
аминогруппой, образуя производные изоиндола с сильной флуоресценцией. В 
качестве тиольных соединений могут быть использованы 2-меркаптоэтанол и 3-
меркаптопропионовая кислота. ОФА не обладает флуоресценцией и, 
следовательно, не образует мешающих пиков. Кроме того, его растворимость и 
стабильность в водном растворе, наряду с высокой скоростью реакции, позволяет 
проводить автоматическую дериватизацию с использованием автодозатора для 
смешивания испытуемого образца и реагента. Основным недостатком ОФА 
является отсутствие у него способности реагировать со вторичными 
аминокислотами (например, пролином). Компенсировать данный недостаток 
можно сочетанием с методиками, описанными в методах 7 или 8.


Предколоночная дериватизация аминокислот с ОФА используется для 
пробоподготовки перед обращенно-фазовой ВЭЖХ. Так как ОФА-производные 
аминокислот неустойчивы, анализ и разделение методом ВЭЖХ проводят 
немедленно после дериватизации. Хроматограф для жидкостной хроматографии 
должен быть оснащен флуометрическим детектором для обнаружения 
производных аминокислот. Интенсивность флуоресценции ОФА-производных 
аминокислот измеряют при длине волны возбуждающего света 348 нм и длине 
волны излучаемого света 450 нм.
Заявленный предел обнаружения при флуориметрическом детектировании 
не ниже 50 фмоль, однако на практике предел обнаружения составляет 1 пмоль. 
МЕТОД 6. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С (ДИМЕТИЛАМИНО)-
АЗОБЕНЗОЛСУЛЬФОНИЛХЛОРИДОМ 
Предколоночная 
дериватизация 
аминокислот 
с 
(диметиламино)азобензолсульфонилхлоридом 
(ДАБС) 
проводится 
перед 
Download 209,86 Kb.

Do'stlaringiz bilan baham:
1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   13




Ma'lumotlar bazasi mualliflik huquqi bilan himoyalangan ©hozir.org 2024
ma'muriyatiga murojaat qiling

kiriting | ro'yxatdan o'tish
    Bosh sahifa
юртда тантана
Боғда битган
Бугун юртда
Эшитганлар жилманглар
Эшитмадим деманглар
битган бодомлар
Yangiariq tumani
qitish marakazi
Raqamli texnologiyalar
ilishida muhokamadan
tasdiqqa tavsiya
tavsiya etilgan
iqtisodiyot kafedrasi
steiermarkischen landesregierung
asarlaringizni yuboring
o'zingizning asarlaringizni
Iltimos faqat
faqat o'zingizning
steierm rkischen
landesregierung fachabteilung
rkischen landesregierung
hamshira loyihasi
loyihasi mavsum
faolyatining oqibatlari
asosiy adabiyotlar
fakulteti ahborot
ahborot havfsizligi
havfsizligi kafedrasi
fanidan bo’yicha
fakulteti iqtisodiyot
boshqaruv fakulteti
chiqarishda boshqaruv
ishlab chiqarishda
iqtisodiyot fakultet
multiservis tarmoqlari
fanidan asosiy
Uzbek fanidan
mavzulari potok
asosidagi multiservis
'aliyyil a'ziym
billahil 'aliyyil
illaa billahil
quvvata illaa
falah' deganida
Kompyuter savodxonligi
bo’yicha mustaqil
'alal falah'
Hayya 'alal
'alas soloh
Hayya 'alas
mavsum boyicha


yuklab olish