|
3-ШУЪБА
ҚИШЛОҚ ХЎЖАЛИГИ ЭКИНЛАРИ СЕЛЕКЦИЯСИ ВА УРУҒЧИЛИГИ.
ЎСИМЛИКЛАРНИ ҲИМОЯ ҚИЛИШ ВА АГРОБИОТЕХНОЛОГИЯСИ
СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ КОРЕНЬ-СПЕЦИФИЧНОЙ
ЭКСПРЕСИИ ГЕНОВ В РАСТЕНИЯХ
З.Т.Буриев, Х.С.Рузибаев, Х.А.Убайдуллаева
Центр геномики и биоинформатики АН РУз
Сельское хозяйство в Узбекистане как и во многих других странах играет важную роль в
экономике страны. Однако, вследствие воздействия патогенов ежегодно на полях теряется огромное
количество урожая. Согласно статистике оказываемый фитопатогенами ущерб в сельском хозяйстве
составляет миллиарды долларов. Галловая нематода также наносит огромный ущерб сельскому хозяйству.
Она живѐт и размножается в слоях почвы, и поражает корневые ткани растений, в том числе и
хлопчатника, что приводит к гибели растений. Ген
MIC
-3 (Meloidogyne Induced Cotton-3) хлопчатника
высоко экспрессируется исключительно в корневых тканях [1, 2]. Исследованиями показано, что этот ген
у видов
Gossypium
повышает устойчивость хлопчатника к нематоде [3,4]. Это предоставляет возможность
получения генотипов растений резистентных к галловой нематоде. Кроме того, использование
промоторного региона данного гена в генной инженерии повзволит эксперссировать нужные гены в
исключительно в корневых тканях растений. Промоторы являются важными инструментами в
биотехнологии растений. Они позволяют эффективно управлять экспресией генов. В течение многих лет
промоторы выделяются из генома разных видов организмов и используются в генной инженерии [5].
Идентификация корень-специфических промоторов является актуальной задачей и имеется
возможность широкого их использования в генной инженерии растений. Например, пользуясь генной-
инженерией можно уменьшить засорѐнность почв, защитить растения от засухи и засоления, улучшить
усвоение макро и микро элементов, повысить резистентность к корневым патогенам [5]. Корень является
первым органом растения чувствующий ионные, осмотические и другие стрессовые факторы. Эти стрессы
появляются в результате засухи, засоления почвы, накопления в почве тяжелых металлов, нехватки
питания и присутствия микроорганизмов в ризосфере [8]. Кроме того, корневая система регулирует
процесс снабжения растений водой и питанием, что важно для развития растений и количества урожая.
Оверэкспрессия белков расположенных в корнях предоставляет возможность улучшения развития
растений и повышения их резистентности к стрессам [9]. Поэтому интерес к исследованиям по
идентификации корень-специфических промоторов повышается.
Были определены и выделены несколько корень-специфических промоторов, например, промотор
гена
TobRB7
табака. Его экспрессия выявлена в меристемах корней и не развитых центральных
цилиндрических регионах [10].
Целью этого исследования является создание векторной конструкции, на основе промоторного
региона гена
MIC-
3
хлопчатника, позволяющий специфически экспрессировать любой ген исключительно
в корневых клетках растений.
Мы сконструировали несколько праймерных пар для амплификации различных фрагментов
промоторного региона. Конструированные праймерные пары имеют на своих концах рестрикционные
сайты ферментов, что необходимо для инсерции в вышерасположенный регион бинарных плазмидных
векторов, содержащих репортерный ген
GUS
. Основываясь на данных нуклеотидных последовательностях
промотора мы амплифицировали весь промоторный регион гена
MIC-
3 длиной в 2.5 тыс. п.о. из линии
хлопчатника TM-1 и конструировали несколько бинарных векторов нацеленных на весь регион длиной в
2.5 тыс. п.о. и несколько фрагментов с малыми размерами из последовательностей промотора для
изучения роли промотора в устойчивости к RKN. Промотор длиной в 2562 п.о. был ремплифицирован при
помощи пары праймеров несущих адаптеры рестрикционных сайтов HindIII и BamHI. Более короткие
фрагменты промоторов, имеющие делецию различной длины 5'-конца были также амплифицированы с
помощью специфических праймеров. Эти промоторные фрагменты были вставлены в общедоступный
вектор pBI101, в вышерасположенный регион кодирующего региона гена
GUS
.
В результате этого были созданы серии бинарных векторов pBI101-
MIC3
_Pr::GUS названные P-
2500 (-2500/-1, 2500 bp), P-2200 (-2200/-1, 2200 bp), P-1800 (-1882/-1, 1882 bp), P-1600 (-1658/-1, 1658 bp),
P-1300 (-1381/-1, 1381 bp), P-1000 (-1057/-1, 1057 bp), P-700 (-708/-1, 708 bp). Эти векторы были
перенесены в штаммы LBA4404 (для трансформации хлопчатника) или GV3101 (для трансформации
арабидопсиса) бактерии
Agrobacterium tumefaciens
и использованы для
in planta
трансформации
арабидопсиса.
Do'stlaringiz bilan baham: |
