196
СОЗДАНИЕ ВЕКТОРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ЛИНИЙ ХЛОПЧАТНИКА УСТОЙЧИВЫХ К ФУЗАРИОЗНОМУ
ВИЛТУ
FUSARIUM OXYSPORUM F.SP. VASINFECTUM
.
Т.М.Норов, З.Т.Буриев, И.Ю.Абдурахмонов
ЦЕНТР
Центр Геномики и биоинформатики АН РУз
Развитие биотехнологии позволило развитым странам быстрыми темпами создать новые сорта
сельхозкультур с улучшенными свойствами. Таким путем ученым удалось получить трансгенные сорта
хлопчатника устойчивых к насекомым, гербицидам и грибам. Данные технологии оказались
эффективными в создании новых улучшенных сортов растений. Особо следует
отметить в этом плане
технологию РНК интерференции (RNAi), которая появилась относительно недавно и является наиболее
эффективной методикой для получения трансгенных растений.
Технология РНК интерференции основана на пост транскрипционном подавлении функции гена.
Специфическая РНК интерференция (RNAi) – деградация мРНК генов растений с использованием
конструкций, кодирующих шпилечные дуплексы РНК, эффективно используется в функциональной
геномике нематоды
Caenorhabditis elegans
и в настоящее время широко применяется на растених. Данная
технология позволяет точнее и эффективнее нокаутировать
желаемый ген и получить, соответственно,
необходимый фенотип. На сегодняшний день существуют различные RNAi векторные системы, которые
можно применять в исследованиях, и они широкодоступны на мировом рынке. Однако при желании
использовать их для производства новых сортов и линий растений необходимо
иметь разрешения этих
компаний.
Хлопчатник является одной из лидирующих в мире товарных культур, приносящих в бюджет
хлопкосеющих стран огромную прибыль. Поэтому селекционные программы этих стран, в том числе и
Узбекистана, направлены на создание новых и высококачественных
сортов хлопчатника, устойчивых к
различным биотическим и абиотическим факторам окружающей среды. Несмотря на эти старания
селекционеров ежегодно на полях из-за патогенов теряются огромные площади посевов хлопчатника.
Одним из таких патогенов является
Fusarium oxysporum
f.sp.
vasinfectum
(FOV),
который вызывает вилт
хлопчатника [1]. В настоящее время в США угроза распространения FOV имеет первостепенное значение,
так как на хлопковых полях Калифорнии была обнаружена новая высокопатогенная 4-я раса FOV [2]. Все
это указывает на необходимость ускорения создания новых устойчивых к вилту сортов хлопчатника.
Группа ученых смогла получить генно-модифицированные линии хлопчатника, устойчивы к
насекомым, путем введения в геном хлопчатника RNAi векторную конструкцию содержащей
двухцепочечный РНК-дуплекс, соответствующий гену фермента монооксигеназы Р450 насекомого [3].
Целью данной работы является создание RNAi векторной конструкции для гена
FoSTUA
гриба,
позволяющая подавлять экспрессию этого гена в растительных клетках и
способствующая устойчивости
хлопчатника к фузариозному вилту (
Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum
).
В рамках данного исследования учеными Центра были исследованы несколько генов
Fusarium
oxysporum
(FOV), которые играют важную роль в онтогенезе данного патогена. Одним из таких генов,
является ген
FoSTUA
, регулирующий образование микро и макро-конидий фузариозного гриба [4]. Этот
ген был уже секвенирован в нашей лаборатории из генома местной расы гриба FOV.
Образцы геномной ДНК выделяются из гриба
Fusarium oxysporum
f.sp.
vasinfectum
. Реакция ПЦР
проводится с использованием геномной ДНК в концентрации 50 нг. Для клонирования полученных ПЦР -
продуктов используют ТОРО ТА клонирующий вектор pCR4-ТОРО и ТОР10 клетки
Esherihia coli
(Фирма
«Invitrogen», США). Эксперименты по клонированию и трансформации проводят в соответствии с
инструкциями производителя. Клоны E. сoli, выращенные на среде LB с добавлением канамицина в
концентрации 50мкг/мл в течение суток, отбирают для получения ПЦР - продуктов путем амплификации
рекомбинантных плазмид из ТОРО ТА клонов
E. coli
. Рекомбинантные плазмиды выделяют с помощью
набора «Miniprep» (Фирма «Invitrogen», США). Секвенирование вставок
плазмиды проводят с помощью
реакционной смеси Big Dye терминатора на оборудовании ABI 3130xl (Фирма «Applied Biosystems»,
США). Полученные данные анализируют с помощью компьютерной программы SEQUENCHER 4.0
(США). Для выравнивания нуклеотидных последовательностей используют компьютерную программу
«CLUSTALX».
Данные о геномной последовательности
гена
FoSTUA
анализируются в базе данных «Gene Bank»
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Последовательности обработаны с помощью компьютерной программы
SEQUENCHER 4.0 (США). Были созданы несколко праймеров для секвенирования гена
FoSTUA
гриба
Fusarium oxysporum
f.sp.
vasinfectum
. Используя праймерные пары созданные для гена
FoSTUA
нами была
осуществлена амплификация, клонирование и секвенирование.
Для создания генетической конструкции использована бинарная векторная система pART27 и
регион гена
FoSTUA
. Бинарные плазмиды pART27 разрезаются рестрикционными
ферментами XhoI
197
(GGT) и XbaI (СТAGA) («Fermentas», Lithuania). Для фракцирования разрезанных плазмид
осуществляется электрофорез в агарозном геле. Для очищение фрагментов плазмид из агорозной гели
использовали метод фенол/хлороформа. Для связывания разрезанной плазмиды pART-27 с синтетическим
дуплексам гена
FoSTUA
используется метод лигазы.
Таким образам была создана RNAi векторной конструкции для гена
FoSTUA
гриба, позволяющая
подавлять экспрессию этого гена в растительных клетках и способствующая устойчивости хлопчатника к
фузариозному вилту (
Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum
).
Do'stlaringiz bilan baham: 
