Введение. Цель, задачи предмета

Контрольные вопросы

1. 
   Роль нуклеиновых кислот в микробной клетке.
   
2. 
   Пути утилизации нуклеиновых кислот в микробной клетке.
   
3. 
   Классификация нуклеаз.
   
4. 
   Отличие между экзо- и эндонуклеазами.
   
5. 
   Методы очистки ферментных препаратов.
   

РАБОТА 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНВЕРТАЗЫ.

Цель работы: Ознакомление с технологией получения 6-аминопенициллановой кислоты гидролизом бензилпенициллина с помощью иммобилизованного фермента, овладение лабораторными навыками проведения процессов с иммобилизованными ферментами, определение выхода продукта.
6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК) является полупродуктом в химическом синтезе ряда полусинтетических антибиотиков. Современная технология получения 6-АПК состоит из следующих основных стадий:

• 
  получение биомассы клеток E.coli, содержащих фермент бензилпенициллинацилазу;
  
• 
  выделение и очистка фермента;
  
• 
  иммобилизация фермента в полиакриламидный гель;
  
• 
  получение 6-АПК.
  

Последняя стадия включает в себя проведение следующих операций:

• 
  гидролиз бензилпенициллина иммобилизованным ферментом;
  
• 
  осветление гидролизной жидкости углем и отделение угля;
  
• 
  осаждение 6-АПК в изоэлектрической точке;
  
• 
  фильтрация и промывка полученного осадка 6-АПК водой и органическим растворителем;
  
• 
  вакуум-сушка готового продукта.
  

Клетки E. сoli выращивают методом глубинной ферментации в течение 24 ч в слабощелочной среде, содержащей очищенный кукурузный экстракт и фенилуксусную кислоту, при 25С при постоянном перемешивании и аэрации. По окончании ферментации клетки отделяют от культуральной жидкости сепарацией или центрифугированием. Полученную пасту используют для извлечения фермента с помощью следующих технологических операций:

• 
  экстракция пенициллинацилазы 0,9% раствором бутилацетата в воде при рН 8 и 40С;
  
• 
  отделение отработанных клеток фильтрацией;
  
• 
  осаждение неактивных примесей (балластных белков) из бесклеточного экстракта при 5÷8С путем добавления к экстракту сухого сульфата аммония до концентрации 20 мас.%, перемешивании в течение 30 мин и с последующим отделением балластных белков сепарацией или центрифугированием;
  
• 
  осаждение активного белка-фермента и его отделение. Для этого к осветленному экстракту при 5÷8С вновь добавляют сульфат аммония до уровня 12 мас.%, полученную смесь выдерживают 20 ч, при этом из экстракта выпадает осадок, содержащий преимущественно целевой фермент пенициллинацилазу;
  
• 
  вакуум-сушка полученного фермента.
  

Приготовленный таким образом ферментный препарат подвергают иммобилизации в полиакриламидный гель.
Получение иммобилизованной пенициллинацилазы состоит в радикальной полимеризации акриламида и N,N-метилен-бис-акрил-амида в водной среде в присутствии инициаторов – персульфата аммония (NH4)2S2O8 N,N,NN-тетраметилендиамина. В реакционную смесь вводят бифункциональный реагент – глутаровый альдегид, под действием которого молекулы фермента ковалентно связываются с мономерами и сшиваются друг с другом.
Приготовление иммобилизованного фермента завершают промывкой полученного геля водой.
Процесс получения 6-АПК включает в себя последовательное проведение ряда вышеуказанных операций, выполнение которых и составляет экспериментальную часть данной лабораторной работы.