Введение. Цель, задачи предмета

Получение РНК-азы
Обычно РНК-азу выделяют из свежей бычьей поджелудочной железы путем экстракции 0,25 н серной кислотой при 0÷5^оС. Для очистки от балластных белков в реакционную массу добавляют сернокислый аммоний до концентрации 65%. При этом в осадок переходят трипсиноген, химотрипсиноген и дезоксирибонуклеаза. Затем в фильтрат добавляют сернокислый аммоний до 85% концентрации. При этом в осадок выпадает рибонуклеаза. Полученный фермент можно в дальнейшем очистить перекристаллизацией из этилового спирта.
В данной работе для осаждения РНК-азы используется прием осаждения в изоэлектрической точке (для РНК-азы 8,5÷9,1).
Ход работы
1. 100 г свежей поджелудочной железы быка смешивают с ледяной 0,25 н серной кислотой при 5^оС в соотношении по объему 1:2, т.е. на 100 г железы берут 200 мл 0,25 н серной кислоты и 33,5 мл 96% этанола, который необходим для повышения эффективности фильтрации на последующих стадиях технологического процесса.
2. Суспензию выдерживают при 0÷5^оС в течение 6 ч. Затем суспензию фильтруют через бумажный фильтр. В фильтрате измеряют содержание белка по методу Лоури и активность РНК-азы по методу Кальницкого. Пробу для анализа необходимо развести в 50 раз дистиллированной водой.
3. Полученный фильтрат защелачивают 25% раствором аммиака до рН 7,8÷8,0. Раствор с осадком оставляют на 1 ч в холодильнике.
4. Осадок рибонуклеазы отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 мин. Измеряют объем надосадочной жидкости. Осадок промывают в центрифужных стаканах 10÷20 мл 96% этанола и высушивают в центрифуге при 2000 об/мин в течение 20 мин.
5. В надосадочной жидкости измеряют активность по методу Кальницкого и содержание белка по методу Лоури. Пробу для анализа необходимо развести в 25 раз дистиллированной водой.
6. Полученный осадок РНК-азы взвешивают на аналитических весах и определяют выход препарата по отношению к массе исходной поджелудочной железы.
7. В 100 мл воды растворяют 10 мг РНК-азы и определяют активность РНК-азы по методу Кальницкого и содержание белковых веществ по методу Лоури.
8. По результатам работы рассчитывают степень осаждения общего белка и степень осаждения рибонуклеазы в изоэлектрической точке:
Х_Р = 1-(с_нж∙V_нж/с_ир∙V_ир);
Х_ИЭТ = 1-(А_нж∙V_нж/А_ир∙V_ир),
где с_нж и с_ир – соответственно концентрации белка в надосадочной жидкости и в исходном растворе, г/л;
А_нж и А_ир – соответственно активность РНК-азы в надосадочной жидкости и в исходном растворе, ед/л;
V_н/о и V_и – соответственно объем надосадочной жидкости и исходного раствора, л.