Учебное пособие по курсу «Медицинская биохимия» /Л. А. Ганеева, Л. И. Зайнуллин

Работа 38. Определение содержания билирубина и его фракций в 
сыворотке крови колориметрическим диазометодом 
(по Йендрашику — Клеггорну — Грофу) 
Принцип метода. 
При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотисто-
кислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая, реаги-руя 
со связанным билирубином сыворотки, дает розово-фиолетовое окраши-вание. По 
интенсивности его судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую 
реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный 
билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря 
чему он также вызывает розово-фиолетовое окрашивание раствора со смесью 
диазореактивов. По интенсивности последнего фотометрически определяют 
концентрацию общего билирубина. По разнице между содержани-ем общего и 
связанного билирубина находят количество свободного. 
Реактивы и оборудование: 
Кофеиновый реактив: 5 г чистого кофеина, 7,5 г бензойно-кислого натрия 
(С
6
Н
5
СООNа), 12,5 г кристаллического уксуснокислого натрия (СН
3
СОONа) 
растворяют в 90 мл теплой дистиллированной воды, нагревают содержимое 
колбы до 50–60 °С и тщательно перемешивают. После охлаждения доводят 
объем дистиллированной водой до 500 мл. Раствор годен в течение 3–4 не-
дель при 5–10 °С. Диазосмесь: а) диазореактив I. 5 г сульфаниловой кислоты 
растворяют при подогревании в 300–400 мл дистиллированной воды, прибав-
ляют 15 мл концентрированной соляной кислоты (плотность 1,19 кг / л). Если 
часть сульфаниловой кислоты остается в осадке, колбу помещают в теплую 
воду и ее содержимое помешивают. Только после полного растворения суль-
фаниловой кислоты и охлаждения раствора объем колбы доводят дистилли-
рованной водой до 1 л. Реактив стойкий, хранят в посуде из темного стекла; 
б) диазореактив II. Раствор азотистокислого натрия (NaNO
2
, 0,5 г / дл). Ре-
актив нестойкий, содержится в склянке из темного стекла около 2–3 недели, 
169 

---

в холодильнике при 4 °С. Первым признаком его непригодности служит появ-
ление желтого оттенка. Непосредственно перед выполнением исследований 
смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II. 
Физиологический раствор (раствор NaСl, 9 г/л).