Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева

4.6. Препаратларни бўяш ва фиксациялаш
Гибрид молекулаларни детекция қилишдан кейин препаратлар флуоресцентли буёқлар билан бўялади ва фотоҳимояловчи эритмага солинади. Биринчи муолажа бўялган хромосомаларда, интерфазали ядроларда, ҳужайраларда ва ҳк. бевосита флуоресцент сигналларни кузатиш имкониятини беради, бу олинган натижаларни таҳлил қилишни осонлаштиради. Иккинчиси – флуорохромларни куйиб кетишдан сақлайди. Бўяш ва мустаҳкамлаш алоҳида ёки бир вақтнинг ўзида бажарилиши мумкин. Охирги ҳолатда бўёвчи моддани фотоҳимояловчи эритмага солинади.
Гибрид молекулаларни детекциясида FITC қўлланилганлиги учун фотоҳимояловчи эритмага проподиум йодид ва DAPI эритмалари қўшилади.
Эритмалар

1. 
   Фотоҳимояловчи фиксацияловчи эритма:
   

• 
  0,23 г 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октан (DABCO)га 1мл 0,2 М Tris-HCl қўшилади, pH 7,5 ва чайқаш ёки пипеткалаш ёрдамида аралаштирилади;
  
• 
  9 мл 95-99% ли глицерин қўшилади;
  
• 
  аралашма +70°С да эритилади (шейкерда ёки пипеткалаш билан); эритма гомоген бўлганда уни хона ҳароратида бир нечта соатга ёки тунга қолдирилади;
  
• 
  эритма +40°С гача иситилади ва тешиклари 45 мкм бўлган филтр орқали филтрланади;
  
• 
  эритмани 1-2 мл дан тортиб қадоқланади ва -20°С да сақланади.
  

2. 
   DAPI эритмаси.
   

Бош эритма: 1 мг/мл дистилланган сувда, –20°С да сақлаш.

3. 
   Пропидиум йодид эритмаси.
   

Бош эритма: 1 мг/мл дистилланган сувда, –20°С да сақлаш.

4. 
   DAPI тутган фотоҳимояловчи мустаҳкамловчи эритма: (0,5­1 мкг/мл фиксацияловчи эритмада):
   

• 
  бўявчи бош эритманинг 0,5-1 мкл даги ҳажми 1 мл фиксацияловчи эритма тутган эппендорф деворига эҳтиётлик билан қўйилади; тезлик биан центрифугалаш билан чўктирилади;
  
• 
  пипеткалаш орқали 5-6 марта эҳтиёткорлик билан аралаштирилади ва тезда центрифуга ёрдамида чўктирилади;
  
• 
  эритма –20°С да ярим йилгача сақланади;
  
  • 
    препаратга қўйишдан олдин эритма қоронғу жойда 20-30 дақиқа +37°С да ушлаб турилади.
    

5. 
   Проподиум йодид сақловчи фотоҳимояловчи эритма: 0,5-1 мкг/мл фиксацияловчи эритмада; тайёрлаш – қаранг DAPI тутган фотоҳимояловчи фиксацияловчи эритма.
   
6. 
   Проподиум йодид ва DAPI сақловчи фотоҳимояловчи эритма: иккита бўёқни юқорида кўрсатилган концентрацияларда бир вақтнинг ўзида фиксацияловчи эритмага қўшиш; тайёрлаш – қаранг DAPI тутган фотоҳимояловчи фиксацияовчи эритма.
   

Протокол

1. 
   Препаратларга флуоресцент бўёқни (бўёқларни) тутган 40-45 мкл фиксацияловчи эритма қўйилади, 24х50 ёки 24х60 мм ли қопловчи ойна билан ёпилади (бошқа ўлчамдаги ойналар ишлатилганда қўйилаётган эритма ҳажми мос равишда ўзгартирилади).
   
2. 
   Препаратлар хона ҳароратида 20-30 дақиқада ёки бутун тун +4°С да совутгичда бўялади.
   

Эслатма
Фиксацияни флуоресцент детекция тугаши биланоқ, препаратлар қуриганда бажариш керак.

4.6. Микроскопия

FISH дан кейин препаратлар мос нур филтрлар билан жиҳозланган флуоросцент микроскоп ёрдамида таҳлил қилинади. Жадвалда флуорохромларни визуализация қилиш учун ишлатишга мўлжалланган битта, иккита ва учта нур филтрларининг вариантлари келтирилган.

Флуорохром	Флуорохром ранги	Қўзғатувчи филтр	Нур чиқарувчи пластинка	Беркитувчи филтр
DAPI	кўк	365	395	397
Проподиум йодид	тўқ-қизил	546	580	590
Проподиум йодид	оч-қизил	460-490	510	520
FITC	сариқ-яшил	460-490	510	520
TRITC	пушти	460-490	510	520
TRITC	қизил	546	580	590
FITC/TRITC	сариқ-яшил/пушти	485 ва 546	440/505	515-530 ва 580-630
DAPI/ FITC/TRITC	яшил/сариқ/малина ранг	400/495/570	410/505/585	460/530/610

4.7. FISH дан кейин препаратларни сақлаш
Фото сақловчи эритмага солинган фиксацияланган препаратларни ёпиқ қутида +4°С да сақлаш керак. FISH босқичларининг барчаси тўғри бажарилганда таҳлил этилган препаратлар 2-3 йил ва ундан кўп муддатгда сақланиши мумкин. Агар хромосомалар (интерфазали ядролар, ҳужайралар) морфологияси сақланган бўлса, флуоресцент сигналлар кучсиз бўлиб қолганда, зарурат бўлса қопловчи ойналар устара ёки скалпел билан секингина олинади ва препарат бир нечта маротаба дистилланган сув ювиш, спиртлар сериясида дегидратациялаш ва гибридизацион сигналларни кучайтириш, ва препаратларни юқорида кўрсатиб ўтилганидек фиксациялаш мумкин.


Машғулотлар режаси.
Назарий материални ўзлаштиргандан сўнг талабалар юқорида берилган протоколларни бажаришади. Хромосомаларнинг тайёр микропрепаратларини олгандан сўнг микроскопнинг иммерсион обективи остида кариотиплаш амалга оширилади.
Кариотипни ўрганиш метафазали пластинкалар микропрепаратларини кўриб чиқишдан бошланади. Кейин талабалар хромосомалар тўплами фото нусхаларини ишлатган ҳолда кариограммани тузишади. Айрим хромосомаларни Одам хромосомалари Халқаро номенклатурасига (ISCN) биноан кесиб олинади ва тақсимланади, бунда уларнинг ўлчамлари, елкалар узунликлари, центромерлар жойлашиши ва бошқа белгилар ҳисобга олинади. Кариограмма тузилганидан сўнг хромосом тўплам (хромосома тўплами қайси жинсга тааллуқли, аберрациялар бор-йўқлиги) ҳақида хулоса қилинади. Кейин талабалар текширилган кариотипни умум қабул қилинган қисқартмалар ва белгилар кўринишида (кариотип формуласи) ёзиб олишади.
FISH таҳлилни ўтказишни ўрганиш талабалар томонидан керакли эритма ва буферларни, хромосомалар препаратларини тайёрлаш ва текширув протоколларини бажаришдан бошланади. Талабалар бош ДНК-зондларни тайёрлаш, препаратларни гибридизациядан олдин қайта ишлашни, in situ гибридизацияни, хромосомаларни флуоресцент буёқлар билан бўяшни, флуоресцент микроскоп ёрдамида таҳлил қилишни амалга оширишни ўрганишади.
Ўқитувчи талабалар билимини баҳолаган ҳолда барча босқичларда амалий баёномаларнинг тўғри бажарилганлигини текширади, олинган препаратларни талабалар билан бирга таҳлил қилади, олдин олинган хромосомалар препаратлари билан тарқатма материалларни таҳлил этади (мисол 6-8-расмларда), келгуси машғулот масалаларини тушунтиради.



a

b

Расм 6. Маркерли der хромосомасини идентификациялаш (7). ФГА-стимулацияланган лимфоцитлардан тайёрланган метафазали пластинкалар: 7-хромосоманинг марказ атрофи туманига специфик бўлган ДНК-зонд (а) ва тўлиқ хромосомали ДНК-зонд (b) билан FISH..

a

b

c

Расм 7. Аберрант Х-хромосоманинг наслдан-наслга ўтиши – Шерешевский-Тернер синдроми (а). Пробанд периферик қонидан олинган ФГА-стимулланган лимфоцитларнинг метафазали пластинкалари (b, c); b – Xp21(965C5) (46,Х,del(X)(p21→pter кариотипи) локус-специфик зонд билан FISH; c – аберрант Х-хромосоманинг кеч репликацияси (RBA усули).

Расм 8. Оилада der(13 or 21) маркерли хромосомани идентификациялаш ва наслдан-наслга ўтиши (а). Йўлдошнинг цитотрофобластидан тайёрланган “бевосита” препаратларида rDNA (b) ва D13Z1/D21Z1 ДНК-зонди билан (c) FISH.


Вазиятий масалалар.
Антропогенетиканинг цитогенетик услублари

1 . Препаратда “Сут бези найчаси эпителиал ҳужайраларида ERBB2 онкогени in situ хромоген гибридизацияси”. Эпителиал ҳужайраларнинг ядроларида қўнғир рангли нуқта кўринишидаги иккита нишон аниқланади – бўёқ билан боғланган ДНК-зонднинг ERBB2 гени билан комплементар ўзаро таъсири натижаси. Нима сабабли меъёрда ҳар доим иккита қўнғир рангли нишон аниқланишини тушунтиринг.

2 . Препаратда “Сут бези саратони кесимида ERBB2 онкогенининг in situ хромоген гибридизацияси”. Ўсма ҳужайрларининг ҳар бир ядросида қўнғир рангли донадорлик кўринади – II типдаги эпидермал ўсиш омили гени – ERBB2 онкогени билан комплементар ўзаро таъсир қилувчи, ДНК-зонд билан боғланган буёқнинг ҳужайрада мавжудлиги натижаси. Зерно лар сони ушбу ген аллелари сонига тенг. Одатда, зерно лар сони иккига тенг меъёрдан ортиқ бўлади ва 6 гача етиши мумкин. Сут бези саратони ҳужайраларида аниқланган донадорликнинг ошиб кетишини қандай тушунтирса бўлади?

3 . Препаратда HER2/neu оқсилнинг иммуногистокимёвий усулда бўялган препаратида юмалоқ ёки чўзинчоқ шаклдаги ўсма ҳужайраларининг тўплами тасвирланган. Ҳар бир ҳужайра кўк ядросига ва аниқ қўнғир рангга бўялган цитоплазматик мембранага эга. Мембрананинг бундай бўялиши 17-хромосомада жойлашган ERBB2 онкогени фаоллиги маҳсулоти HER2/neu оқсилининг жуда кўплиги билан боғлиқ. Ушбу оқсил, меъёрда жуда ҳам кўп бўлмаган миқдорда учровчи II типдаги эпидермал ўсиш омили рецептори ҳисобланади. Сут бези саратони ҳужайраларида HER2/neu оқсилининг кўп синтезланишига нима сабаб бўлади?

4. Сизга Х-жинсий хроматинни аниқлаш учун бўялган икки ҳужайра сурати кўрсатилган.

1) ушбу ҳужайраларнинг қайси бири соғлом аёлга тегишли?
2) А ҳарфи остида кўрсатилган соматик ҳужайрада одам кариотипида нечта Х-жинсий хромосома мавжуд?

5. Одам кариограммасини ўрганиб чиқинг.
1) Ушбу одам краиотипи нечта хромосомани тутади?
2) Кариограмманинг пастки ўнг бурчагида жойлашган хромосомалар қандай номланади?
3) Қолган бошқа хромосомалар қайси термин билан номланади?
4) Чап томондан юқориги иккинчи қаторда жойлашган хромосома қандай номланади?
5) Ушбу кариограммага эга одам жинси қандай?
6) Бу одам қайси хромосом касаллик билан хасталанган?
7) Бундай кариограммага эга одамнинг кариотипи формуласини ёзинг.


Тест саволлари.
1. 33 ёшли аёлдаги хромосом таҳлил кўрсатдики, 16-хромосоманинг калта елкаси бир қисми 22-хромосомага бириккан. Бу ҳодиса қандай номланган?
A. Трансдукция
B. Транслокация+
C. Инверсия
D. Делеция
E. Дефишенс


2. Сувчечакка қарши эмланган боланинг лимфоцитлари 8-култураси метафазали пластинкада Е гуруҳидаги қўшимча хромосома аниқланган. Бу фактни таҳлил этинг ва ушбу мутация қайси типга тегишли эканини аниқланг.
A. транслокация
B. инверсия
C. делеция
D. полиплоидия
E. гетероплоидия+


3. Мутаген таъсири остида ооцитларда иккита Х-хромосома орасида мустаҳкам боғланиш ҳосил бўлди. Бу ҳолат тухум ҳужайрада хромосомаларнинг қандай тўплами ҳосил бўлишига олиб келиши мумкин?
A. 47 хромосома
B. 23 ёки 24 хромосомалар
C. 24 ёки 25 хромосомалар
D. 22 ёки 24 хромосомалар+
E. 46 хромосома


4. Сперматогенезнинг етилиш босқичида хромосомалар бир-биридан узоқлашган вақтида Х-хромосома Y-хромосомадан ажралмади. Агар тухум ҳужайра бундай сперматозоид билан уруғланса бўлғуси турнинг кариотипи қандай бўлади?
A. 45, X0
B. 46, XX
C. 46, XY
D. 47, XYY
E. 47, XXY+


5. Кариотипни ўрганиш учун ҳужайралар културасини бўлиниши ўрчуғини бузадиган колхицин билан қайта ишлашди. Митоз қайси босқичда тўхтатилган бўлади?
A. Телофаза
B. Анафаза
C. Метафаза+
D. Прометафаза 1
E. Профаза


6. Митоз бўлинишга мойил ҳужайраларни тутган озуқа муҳитига радиоактив нишонли тимин қўшилди. Радиографик текширувда ҳужайралар ядроларида аниқланадиган кўп сонли тимин мавжудлиги нима ҳақида далолат беради?
A. Интерфаза босқичидаги ҳужайраларнинг кам миқдори ҳақида.
B. Интерфазанинг синтетик босқичидаги ҳужайраларнинг кўп миқдори ҳақида+.
C. Кучли митотик фаоллик ҳақида
D. Интерфазанинг синтетик давридаги ҳужайраларнинг кам миқдори ҳақида
E. Интерфаза босқичидаги ҳужайраларнинг кўп миқдори ҳақида

7. Организм ҳужайраларида тўғма касаллик мавжуд 7 ёшли болада аномал биополимерлар аниқланди. Қайси органеллалар функцияси бузилиши ҳақида ўйлаш мумкин?

A. Лизосомалар+
B. Митохондриялар
C. Пероксисомалар
D. Рибосомалар
E. Грануляр эндоплазматик тўр

8. Абортланган бола кариотипини ўрганиш вақтида биринчи хромосомаларнинг бири битта елкага эгалиги ва центромернинг терминал жойлашиши аниқланди. Хромосоманинг бундай типи қандай номланади?

A. Акроцентрик
B. Субметацентрик
C. Телоцентрик+
D. Метацентрик
E. Изохромосома


9. Радиоактив нурланиш таъсирида хромосоманинг бир қисми 180° га айланди. Бу хромосомали мутациянинг қайси турига киради?
A. Дупликация
B. Делеция
C. Инверсия+
D. Хромосома ичи транслокацияси
E. Хромосомалараро транслокация


10. Амитоз – бу ҳужайра ядросининг бевосита бўлиниши, бунда ядронинг интерфаза ҳолати сақланиб қолади, ядроча ва ядро мембранаси яхши кўринади. Амитозда хромосомалар аниқланмайди ва уларнинг бир текис тарқалиши содир бўлмайди. Амитоз натижасида генетик хилма-хил ҳужайралар ҳосил бўлади. Одам организми қайси ҳужайрасида амитоз меъёрий ҳолат ҳисобланади?
A. Бластомерларда
B. Сперматогонияларда
C. Ооцитларда
D. Тери эпителийси ҳужайраларида+
E. Гаметаларда.