Тошкент тиббиёт академияси п. Р. Алимходжаева, Н. М. Туйчибаева, А. А. Абдувалиев, М. С. Гильдиева

Протокол 4.2a (лунж эпителийси суртмаларини тайёрлаш)

1. 
   Тоза, ёғсизлантирилган ойнада лунж эпителийси ҳужайралари қириндисидан суртма тайёрлаш, материал шпател ёрдамида бир текис тарқатилади.
   
2. 
   Препарат ҳавода қуритилади.
   

Протокол 4.2b (қон суртмаларини тайёрлаш)

1. 
   Тоза, ёғсизлантирилган ойнада периферик қон томичисидан суртма тайёрлаш, бошқа ойна ёрдамида материал бир текис тарқатилади.
   
2. 
   Препарат хона ҳароратида қуритилади.
   
3. 
   2-3 соатдан кейин препратга 1-2 мл совутилган янги тайёрланган фиксатор (этанол+музли уксус кислотаси) 30-60 сек га қўйилади.
   
4. 
   Фиксатор ёндирилади, ва у тўлиқ ёниб кетишини кутмасдан олов ўчирилади.
   
5. 
   Препарат ҳавода қуритилади.
   

Протокол 4.2.с. Амниотик суюқликнинг култивацияланмаган ҳужайралари препаратларини тайёрлаш
Эритмалар
Гипотоник эритма — 0,56% ли КСl эритмаси.

1. 
   Амниотик суюқлик намуналари 6-8 мл дан центрифуга пробиркаларига солинади ва 1000 айланиш/ дақ да 10 дақиқа центрифугаланади.
   
2. 
   Пипетка ёрдамида эҳтиёткорлик билан чўкма усти суюқлиги олиб ташланади, чўкмага 8 мл гипотоник эритма қўшилади ва аралаштирилади.
   
3. 
   Аралашма 1,5 соат +37°С да термостатда инкубация қилинади.
   
4. 
   10 дақиқа давомида 1000 айланиш/дақ да центрифугаланади.
   
5. 
   Пипетка ёрдамида эҳтиёткорлик билан чўкма усти суюқлиги олиб ташаланади.
   
6. 
   Материал янги тайёрланган фиксатор (этанол+музли уксус кислота, 3:1 нисбатда) билан икки марта фиксацияланади. Фиксация +4°С ҳароратда, биринчисини 10 дақиқа, иккинчисини 20 дақиқа давомида амалга оширилади.
   
7. 
   Ҳужайралар 1000 айланиш/дақ тезликда 10 дақиқа давомида центрифугалаш орқали чўктирилади.
   
8. 
   Пипетка ёрдамида эҳтиёткорлик билан чўкма усти суюқлиги олиб ташланади.
   
9. 
   Чўкмага музли уксус кислотаси қўшилади, пробиркага 8 мл дан, аралаштирилади +4°С да 1,5 соат ушлаб турилади.
   
10. 
    Ҳужайралар 1000 айланиш/дақ тезликда 10 дақиқа давомида центрифугалаш орқали чўктирилади ва чўкма усти суюқлиги эҳтиёткорлик билан олиб ташланади.
    
11. 
    Чўкмага янги тайёрланган 6 мл фиксатор қўшилади, аралаштирилади ва аралашма 10 дақиқа давомида +4°С ҳароратда ушлаб турилади.
    
12. 
    Ҳужайралар 1000 айланиш/дақ тезликда центрифугалаш орқали чўктирилади, чўкма усти суюқлиги эҳтиёткорлик билан олиб ташланади.
    
13. 
    Чўкмага совутилган 6 мл метанол қўшилади, аралаштирилади ва +4°С да 10 дақиқа ушлаб турилади.
    
14. 
    Ҳужайралар 1000 айланиш/дақ тезликда 10 дақиқа давомида чўктирилади, ва чўкма усти суюқлиги эҳтиёткорлик билан олиб ташаланади.
    
15. 
    Чўкмага 1,5-2 мл совутилган метанол қўшилади ва аралаштирилади.
    
16. 
    Ҳужайралар суспензияси 50-100 мкл ҳажмда совутилган ва тоза ойналарга томизилади ва фиксаторни куйдириш орқали қуритилади.
    

4.3. Препаратларни гибридизациядан олдин ишлаш

Тадқиқотчилар томонидан тўпланган тажрибага биноан, FISH учун қандайдир қайта ишлаш ва бўялиш қўлланилмаган, гибридизациядан 2 кун олдин тайёрланган янги препаратларни ишлатиш мақсадга мувофиқдир. Лекин, зарурат бўлганда аввал бўялган, бўёқлардан ювилган (дистилланган сув, спирт, ксилол билан), ва гибридизациядан бир нечта ой (икки-уч йил) олдин тайёрланган препаратларни ҳам ишлатиш мумкин. Тадқиқотни муваффаққиятли амалга оширишнинг муҳим шарти – препаратда цитоплазма ва ҳужайра детритининг минимал миқдори бўлиши ҳисобланади. Қуйида гибридизациядан олдин препаратларни қайта ишлашнинг енгилгина бажариладиган методикаси келтирилган. Уни гибридизациядан олдин бевосита усул билан ёки култивациялашдан кейинги барча турдаги ҳужайралар препаратларини, шунингдек лунж эпителийси ва қон ҳужайраларини қайта ишлашда қўллаш мумкин.
Эритмалар

1. 
   РНКаза А эритмаси.
   

Бош эритма — 10 мг РНКаза А ни 1 мл 2x SSC да эритилади, пробиркани қайнаб турган сув ҳаммомига 10 дақиқага солинади ва хона ҳароратида совутилади. 15 мкл дан тортиб қадоқланади ва эритма 20°С да сақланади.

2. 
   РНКаза нинг ишчи эритмаси (бевосита қўлланишдан олдин тайёрланади) — 985 мкл 2хSSC эритмасига РНКаза А нинг 15 мкл бош эритмаси қўшилади.
   
3. 
   20xSSC эритмаси, pH 7,0 — 3 M NaCl, 0,3 M Na цитрати.
   
4. 
   2xSSC эритмаси, pH 7,0 — 100 мл 20xSSC эритмасига 900 мл дистилланган сув қўшилади.
   
5. 
   10xPBS эритмаси, pH 7,0.
   
6. 
   А эритмаси: 900 мл дистилланган сувда 16,02 г Na₂HPO₄x2H₂O ва 73,84 г NaCl эритилади. Б эритмаси: 200 мл дистилланган сувда 2,76 г NaH₂PO₄ ва 16,56 г NaCl эритилади. А эритма рН Б эритма ёрдамида 7,0 га етказилади.
   
7. 
   Пепсин эритмаси (3000-4000 бирл. фаоллигига эга пепсин ишлатилади, масалан, Sigma, P 6886).
   

Бош эритма — дистилланган сувдаги 10% ли пепсиннинг сувли эритмаси. 100 мкл дан тортиб қадоқлаш ва -20°С да сақлаш керак.

8. 
   Ишчи эритма — бевосита ишлатишдан олдин пепсиннинг бош эритмасининг 60-100 мкл ни 0,01 М HCl нинг 100 мкл га қўшиш керак. Эритма аралаштирилади.
   
9. 
   0,01 М HCl — дастлаб +37°С гача иситилган 100 мл дистилланган сувга концентрацияланган 85 мкл HCl қўшинг. Эритма аралаштирилади.
   
10. 
    Параформалдегид (1% ли ёки 4% ли) эритмасини бевосита қўллашдан олдин тайёрлаш керак:
    

• 
  1 ёки 4 г параформальдегидга 80 мл дистилланган сув ва 7 (ёки 20) мкл 5 N NaOH қўшилади, чайқатиб туриш орқали +50-60°С да эритилади;
  
• 
  эритмага 10 мл 10xPBS ва 1 мл 5 М MgQ₂ эритмаси қўшилади (охирги концентрация 50 тМ);
  
• 
  эритма хона ҳароратигача совутилади;
  
• 
  зарурат бўлса концентрирланган HCl (4-10 мкл) ёрдамида pH 7,0 гача етказилади;
  
• 
  эритма ҳажми дистилланган сув ёрдамида 100 мл га етказилади.
  

11. 
    Денатурация учун эритма — 70% ли деионизацияланган формамид*, 2xSSC, рН 7,0 (70 мл деионизацияланган формамид; 10 мл 20xSSC, рН 7,0; H₂O 100 мл гача).
    

* – формамидни деионизациялаш: формамиднинг 100 мл га 10 г AG 501-X8 ион алмашинган смосласи, 20-50 катакчаси (Bio-Rad) қўшилади, ва магнит аралаштиргичда бир неча соат давомида аралаштирилади. Кейин №1 филтр қоғози орқали аралашма бир нечта марта филтрланади. Филтрланган формамидни зич ёпиладиган шиша ёки пластик идишда сақлаш тавсия этилади.


Протокол

1. 
   Препаратлар +60°С да 1 соат ушлаб турилади.
   
2. 
   Препаратлар спиртлар сериясида (70°, 80°, 96° этанол), ҳар бирида 5 дақиқа давомида дегидратацияланади.
   
3. 
   Препаратлар ҳавода қуритилади.
   
4. 
   Препаратлар РНКаза А нинг 100 мкл ишчи эритмасига қўйилади, 22х50 мм ли қопловчи ойна билан ёпилади. Препаратларни қайта ишлашни термостатнинг нам камерасида +37°С да 1 соат давомида олиб бориш керак. Агар ДНК-зондлар сифатида текширилаётган тўқимада экспрессияси юқори бўлган рДНК кетма-кетлиги ёки бошқа кетма-кетликлар ишлатилса, бу босқичнинг давомийлигини 2-3 соатгача ошириш керак.
   
5. 
   Хона ҳароратида препаратлар 2xSSC ни уч марта алмаштирилиб ювилади ва кейин +37°С да 1xPBS да, ҳар бир смена да 5 дақиқа давомида чайқатилиб турган ҳолда ювилади.
   
6. 
   Препаратлар пепсиннинг ишчи эритмаси солинган стаканда +37°С да 10 дақиқа давомида қайта ишланади. Зич қобиғи мавжуд ҳужайралар (амниоцитлар, лунж эпителийси, сперматозоидлар ва бошқ.) препаратлари 40-50 дақиқа қайта ишланади. Қон суртмалари 1-2 дақиқа қайта ишланади ёки умуман ишланмайди.
   
7. 
   Препаратлар 1 x PBS эритмасида 5 дақиқа давомида хона ҳароратида чайқатилиб туриб ювилади.
   
8. 
   1% ли параформалдегид эритмаси бор стаканга препаратлар солиниб 10-15 дақиқа давомида фиксацияланади. Қон суртмалари препаратлари учун ёки гистологик кесмалар учун формалдегиднинг 4% ли эритмаси қўлланилади.
   
9. 
   Препаратлар 1xPBS эритмасида 5 дақиқа давомида хона ҳароратида ва чайқатиб турилган ҳолда ювилади.
   
10. 
    Препаратлар спиртлар сериясида (70°, 80°, 96° этанол) ҳар бирида 5 дақиқада деградацияланади.
    
11. 
    Препаратлар ҳавода қуритилади.
    
12. 
    Хромосомалар ДНК сини денатурация қилиш препаратларни денатурация учун мўлжалланган эритмага эга стакан (кювета)га солиб +70-72°С да 2 дақиқа давомида бажарилади. Зич қобиққа эга ҳужайралар учун қайта ишлаш давомийлигини ва ҳароратни ошириш керак – масалан, лунж эпителийси учун +76-80°С да 25 дақиқа денатурация қилиш энг оптимал ҳисобланади.
    
13. 
    Препаратлар тезлик билан –20°С гача совутилган 70% ли этанол эритмасига 2 дақиқага қўйилади.
    
14. 
    Препаратлар –20°С гача совутилган спиртлар сериясида (70°, 80°, 96° этанол) ҳар бирида 5 дақиқа мобайнида дегидратацияланади.
    
15. 
    Препаратлар ҳавода қуритилади.
    
16. 
    Қайта ишланган препаратлар гибридизация учун дарров ишлатилади ёки қуритувчи бор қутида +4°С да бир нечта кун сақлаш мумкин.