Сборник содержит материалы научной мультиконференции «Биотех- нология медицине будущего»

Изучение эффектов СRISPR/Cas9-направленного нокаута малых ядрыш-
ковых C/D-бокс-РНК в клетках человека
Матвеева А.М.
1,2
, Филиппова Ю.А.
1
, Журавлев Е.С.
1
, Семенов Д.В.
1
, Балахонова Е.А.
1
,
Прохорова Д.В.
1
, Маланин С.Ю.
3
, Григорьева Т.В.
3
, Рихтер В.А.
1
, Власов В.В.
1
, Степанов Г.А.
1,2
1
Институт химической биологии и фундаментальной медицины,
Сибирское отделение Российской Академии наук, Новосибирск, Россия 
2
Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия 
3
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
Малые ядрышковые C/D-бокс-РНК (мяоРНК) за счет наличия консервативных 
элементов в своей структуре участвуют в пост-транскрипционном созревании рибо-
сомных РНК и направляют сайт-специфичное 2’-O-метилирование нуклеотидов 
РНК-мишеней. В качестве объекта исследований в работе были выбраны C/D-бокс-
мяоРНК, закодированные в интронах гена длинной некодирующей РНК Gas5. Благо- 
даря наличию последовательностей PAM вблизи функциональных элементов удалось 
сконструировать протоспейсеры и направить разрывы в последовательности 
SNORD74, SNORD75, SNORD77
и 
SNORD80
с помощью системы геномного редакти-
рования CRISPR/Cas9. Для моноклональных клеточных линий, полученных на основе 
фибробластов 293FT, был проведен анализ мутаций в выбранных участках гена 
GAS5
, 
выявлены изменения в уровне мяоРНК-мишеней и их функциональной активности – 
удалось получить линии с подавленной активностью индивидуальной U74, U75 и U80 
C/D-бокс-мяоРНК.
Транскриптом полученных клеточных линий исследовали с применением методов 
массового параллельного секвенирования – были проведены этапы стандартного 
RNA-Seq-анализа polyA фракции и коротких форм РНК, включая мяРНК, микроРНК
и мяоРНК. Результаты анализа подтвердили селективность действия системы редак-
тирования в отношении выбранных малых ядрышковых РНК. Анализ структуры РНК 
гена-хозяина выявил частичные изменения в структуре зрелой формы Gas5 – образо-
вание форм с пропуском экзонов и формирование дополнительных неканонических 
стыков экзонов. Данные RNA-Seq-анализа polyA фракции продемонстрировали изме- 
нение экспрессии большого числа генов, однако, не выделялись группы, связанные
с путями программируемой клеточной гибели. 
Таким образом, была продемонстрирована возможность получения жизне-
способных клеточных линий с нокаутом единичных малых ядрышковых РНК для 
исследования неканонических функций индивидуальных мяоРНК, в том числе и роли
в регуляции экспрессии генов, изучения процессов пост-транскрипционного созре-
вания рибосомных РНК и сборки рибосом.
Исследование проведено при поддержке гранта РФФИ 18-29-07073.

---

Всероссийская мультиконференция с международным участием «Биотехнология – медицине будущего»
29 июня - 2 июля 2019 г., г. Новосибирск, Россия
58