Сборник содержит материалы научной мультиконференции «Биотех- нология медицине будущего»

Разработка стратегии CRISPR/Cas9 опосредованного нокаута генов 
IRF7
и 
IFITM3 
для получения пермиссивной клеточной линии к вирусу гриппа А 
Можаева Е.В.
1,2
, Ещенко Н.В.
1
, Журавлев Е.С.
1
, Сергеева М.В.
1,3
, Комиссаров А.Б.
1,3
, 
Степанов Г.А.
1
1
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
Новосибирск, Россия 
2
Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия 
3
Научно-исследовательский институт гриппа Минздрава России,
Санкт-Петербург, Россия
Вирус гриппа A является респираторным патогеном и периодически вызывает 
эпидемии у людей, а также свиней, птиц и других животных. Отличительной чертой 
данного вируса является его изменчивость как в антигенности, так и в патогенности.
В настоящее время во всем мире для защиты населения от инфекции вирусом гриппа 
используют инактивированные и субъединичные формы вакцин, полученные с ис- 
пользованием куриных эмбрионов. Применение культур клеток в производстве вак- 
цин позволит существенно упростить технологический процесс и сделает его более 
быстрым и экономичным. 
В ходе настоящей работы была разработана общая стратегия направленного 
нокаута генов врожденного иммунного ответа с применением технологии CRISPR/
Cas9 геномного редактирования для создания клеточных линий на основе клеток 
293FT, пермиссивных к различным штаммам вируса гриппа. В качестве мишеней были 
выбраны гены 
IRF7
и 
IFITM3
, продукты которых участвуют в регуляции репликации 
вируса гриппа А. 
Общая стратегия нокаута генов включала:
1. Подбор и конструирование специфичных протоспейсеров к последователь-
ностям выбранных генов при помощи «CRISPR Design Tool» – «Broad Institute GPP», 
(https://zlab.bio/guide-design-resources)
2. Получение плазмидных конструкций на основе вектора pSpCas9(BB)-2A-GFP 
(PX458), несущие необходимые протоспейсеры
3. Нокаут генов-мишеней путем введения точечных разрывов системой CRISPR/
Cas9, закодированной в вектор pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)
4. Получение моноклонов с последующим отбором тех, что содержат мутации, 
обеспечивающие сдвиг рамки считывания
5. Оценка уровня жизнеспособности полученных клеток с помощью анализа 
скорости роста системой xCELLigence (ACEA Bioscience, США)
6. Анализ уровня экспрессии генов в модифицированных клонах при помощи 
методов ОТ-ПЦР и Вестерн-блот
7. Оценка проницаемости вируса в модифицированные клетки путем титрования 
в высоко пермиссивной клеточной линии MDCK и проточной цитофлуориметрии.
В результате нашей работы были получены клоны, несущие мутации в генах 
IRF7
и 
IFITM3
. Показано, что подавление экспрессии гена 
IRF7
приводит к повышению 
скорости роста клеток 293FT относительно немодифицированной культуры. Оценка 
продуктивности наработки модельного вируса гриппа показала, что подавление 
экспрессии выбранного гена в мутантных клетках обеспечивает повышение продукции 
вируса гриппа А.
Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект 
№18-75-10069).

---

Всероссийская мультиконференция с международным участием «Биотехнология – медицине будущего»
29 июня - 2 июля 2019 г., г. Новосибирск, Россия
196