|
Протопластларни ажратиш
Протопласт – целлюлоза қобиғини йўқотган, цитоплазматик
мембрана билан ўралган, ўсимлик ҳужайрасига хос бўлган барча
хусусиятларини ўзида сақлаб қолган ҳужайра.
Хужайра деворининг
ёқлиги хужайрага бегона генетик материалнинг кириб келишини
жуда осонлаштиради. Илк бор протопластларни 1892 йилда Дж.
Клеркер
механик
усулдан фойдаланиб ажратган. Бундай усулда
плазмолизланган
ҳужайраларда
ҳужайра
девори
кесилади,
протопластлар муҳитга чиқади. Ҳозирги вақтда бу усул
модификацияланган, яхшиланган, лекин бир қатор чекланишларга
эга:
унчалик юқори бўлмаган унумдорлик,
фақат экстенсив плазмолизли тўқималардан фойдаланиш
мумкин,
кўп меҳнат талаб қилиши ва узоқ давомийлик.
Протопластларни ажратишнинг бошқа усули –
энзиматик,
ферментлардан фойдаланиш усули. 1952 йилда Салтон лизоцим
ферменти ёрдамида илк бор бактерияларнинг ҳужайра деворини
парчалади. 1960 йилда Коккинг помидор илдизи учларига моғор
131
замбуруғлари (
Myrothecium verrucaria
) культурал суюқлигидан
олинган гидролитик фермент билан ишлов берди ва илк бор юксак
ўсимликларнинг энзиматик усул билан алоҳида ажратиб олинган
протопластларини олишга муваффақ бўлди.
Энзиматик усулнинг механик усулга нисбатан устунлик
жиҳати:
бир вақтнинг ўзида кўп сонли протопластлар ажратиб олинади
(тўқима ёки ҳужайраларнинг 1 граммидан 10 млн. гача),
ҳужайралар кучли осмотик стрессга дучор этилмайди,
ҳужайралар зарарланмайди,
усул нисбатан тез амалга оширилади.
Ҳужайра деворини йўқ қилиш учун уч турдаги ферментлардан
фойдаланилади: целлюлазалар, гемицеллюлазалар ва пектиназалар.
Ферментлар комбинацияси ва уларнинг нисбати ҳужайраларнинг ҳар
бир тури учун ўзига хосдир.
Протопластларни ажратиш уч босқичда олиб борилади:
1.
ферментлар билан ишлов бериш,
2.
ҳужайра деворидан протопластларни ажратиш,
3.
интакт (бузилмаган) протопластларни ҳужайра бўлакларидан
ажратиш.
Nicotiana tabacum
барги тўқималаридан протопластларни
ажратишнинг стандарт усули (Такебе бўйича):
Етилган, шаклланган барг 60-80 кунлик ёшдаги етилган
ўсимликдан ажратиб олинади, 70%ли этанолга ботирилади, кейин эса
15-20 дақиқага кальций гипохлоритининг 10%ли эритмасига солиб
қўйилади ва кўп марта дистилланган сув билан ювилади. Пинцет
ёрдамида пастки эпидермис олиб ташланади, эпидермисдан
тозаланган барглар скальпел билан 4 см
2
ли унчалик катта бўлмаган
бўлакчаларга бўлинади. Эпидермисни яхшилаб олиб ташлаш учун
баргларни бир оз сўлитилади, баргларни кесишдан олдин сув билан
таъминлашни чеклаш ҳам мумкин.
Кейин тўқималарга кетма-кетлик билан ёки бир вақтнинг ўзида
мацерация келтириб чиқарадиган пектиназа ва ҳужайра деворини
парчалайдиган целлюлаза билан ишлов берилади. Ферментларнинг
оптимал концентрацияси ишлов бериш вақти каби турли хил
тўқималар учун индивидуалдир. Протопластлар ферментлар
эритмасида минимал вақт давомида сақланиши лозим, шундан кейин
132
хафсала билан яхшилаб ювиш зарур. Ферментлар бактериал
фильтрлар орқали стерилланади.
Ҳужайрада сув алмашинувининг тартибга солиниши ҳужайра
девори мавжудлиги билан боғлиқ. Протопласт “яланғоч” бўлганда
сув алмашинувини тартибга соладиган компонентлардан бири
йўқолади, шу сабабдан ажратиш ва етиштириш муҳитларининг
осмотик хусусиятлари муҳим аҳамиятга эга бўлади. Протопластлар
енгил плазмолизланган ҳолатда бўлиши учун муҳит бир оз
гипертоник бўлиши керак. Бу шароитлар метаболизм ва ҳужайра
девори регенерациясини секинлаштиради. Осмотик стабилизаторлар
сифатида 0,3-0,8 моль/литр концентрацияли шакар (глюкоза, маннит,
сорбит, ксилоза), ионли осмотиклар (CaCl
2
, KCl) фойдаланилади.
Концентрациялар ҳар бир ўсимлик объекти учун индивидуал
танланади.
Тўқималарга ферментлар билан 15
о
бурчак остида ушлаб
турилган Петри ликобчасида ишлов бериш қулайроқ. Протопластлар
билан ферментлар аралашмаси центрифуга пробиркаларига
ўтказилади. Протопластларни ферментлар аралашмасидан ажратиш
икки усул билан амалга оширилади: центрифугалаш йўли билан
фильтрлаш, ёки флотация. Фильтрлашда аралашма тешикчаларнинг
ўлчамлари 40 мкм бўлган фильтрдан ўтказилади. Бунда фильтрда
ҳужайралар майда парчалари ва уларнинг катта бўлаклари қолади.
Кейинги центрифугалашда протопластлар чўкади, бўлаклар
супернатантда қолади. Қайта центрифугалашда ферментлардан ювиб
тозаланади, шундан кейин протопластлар етиштириш муҳитига
ўтказилади.
Флотация усули О. Гамборг ва ҳамкасблари томонидан 1981
йилда таклиф этилган ва заифлашган протопластлар учун
мўлжалланган. Усул протопластлар органеллалар ёки ҳужайра
девори қолдиқларига нисбатан пастроқ зичликка эга эканлигига
асосланган. Дастлабки аралашмага сахароза эритмаси қўшилади ва
40-80 дан 350 g гача бўлган тезликда центрифугаланади. Тоза
протопластлар сузиб чиқади, бўлаклари тубига чўкади.
Протопластларни
шунингдек
суспензия
ва
ҳужайра
культураридан ҳам ажратиб олиш мумкин. Энг яхшиси – логарифмик
ўсишнинг кечки босқичида хужайра девори осон парчаланадиган
пайтда, протопластлар янада яшовчан бўлганда ажратиш.
133
Кейин протопластлар ҳужайралар етиштириладигани каби
шароитларда
етиштирилади.
Тузлар
таркиби
бирмунча
ўзгартирилиши мумкин. Муҳит осмотик стабилизатор, анорганик
бирикмалар,
углерод,
азот,
витаминлар,
фитогормонлар
манбаларидан ташкил топган. Етиштириш шароитлари: муҳит рН 5,4-
5,8, ҳарорат 22-28
о
С, юқори бўлмаган ёритилганлик даражаси (2000
лк дан юқори бўлмаган).
Протопластлардан чиққан ҳужайралар пролиферациясига 4
омил таъсир кўрсатади:
турларнинг ўзига хослиги ва ўсимлик бошланғич
тўқимасининг физиологик ҳолати,
протопластларни ажратиш усуллари ва шароитлари,
протопластларни экиш зичлиги,
озуқа муҳити таркиби.
Do'stlaringiz bilan baham: |
