Reja: Ekspres usullari

Nuklein kislotalarning izolyatsiya

Reja:

1. Ekspres usullari.

2. Izolyatsiyaning sorbent usullari.

3. Alkogolli yog‘inlar.

PCR uchun namuna tayyorlash, ekstraktsiyaning turli usullari vazifalarga qarab dangasalik. Ularning mohiyati qazib olish bilan bog'liq (dan-tortilish) nuklein kislotalarning (DNK yoki RNK) sinov materialidan olinishi va chiqarilishi yoki begona moddalarni zararsizlantirish.Muntazam laboratoriya amaliyotida nuklein kislotalarni ajratib olish uchun uchta eng keng tarqalgan yondashuvdan foydalaning:

1. Ekspres usullar (DNK ekstrakti uchun ishlatiladi) haroratga asoslangan hujayralarning termal lizisi va keyinchalik santrifüjlash, buning natijasida erimaydigan tarkibiy qismlar trubaning pastki qismida va o'ta suyuqlikda joylashadi PCR uchun DNK o'z ichiga olgan (supernatant) ishlatiladi. Usuldan foydalanish oson, 10-15 daqiqadan ko'proq vaqt talab qilinmaydi, maksimal darajada ta'minlaydi maksimal DNK rentabelligi, ammo tarkibidagi materiallar bilan ishlash samarasiz yuqori miqdordagi aralashmalar va PCR inhibitörleri. Bundan tashqari, usul bo'lishi mumkin emas RNK izolatsiyasi uchun ishlatiladi, chunki RNazlar issiqlikka chidamli. Agar siz "murakkab" namunalar bilan ekspres usullardan foydalanishingiz kerak bo'lsa materialni tozalash va konsentratsiyasining qo'shimcha usullarini joriy etish mumkin, masalan, namunadagi balg'am ko'p bo'lsa (balg'am va ejakulyatsiya uchun bronxoalveo- yuvinish, bronxial yuvish suvi, traxeyani yuvish, sinovial va plevra suyuqlik), oldindan yuvish va davolash tavsiya etiladi mukolitik sifatida. Nuklein kislotalarni ajratish va tozalashning yanada samarali usuli (NK) bunday material bilan ishlashda sorbentlar yoki kuchli ishlatilishi mumkin xotropik vositalar.

2. Izolyatsiyaning sorbent usullari - nuklein kislotaning differentsial sorbsiyasi qattiq tashuvchida kislotalar (ikkala DNKni ham, RNKni ham ajratish mumkin) jami: salbiy zaryad kuchaygan yoki o'zgartirilgan silika jeli sirt, shisha boncuklar, diatomli er, shisha "sut" va boshqalar). Nuklein kislota yuqori darajada xaotropik tuzlarning markazlashishi (masalan, guanidin tiosiyanat). Inhibitorlar va boshqalar klinik materialning tarkibiy qismlari eritmada qoladi. Xaotropik tuzlardan tashqari ko'pincha yuvish vositalari bu hissa qo'shadigan lizis tamponida mavjud oqsillarning erishi va lizisi. Santrifüj bilan NR bilan kremniy cho'kadi va PCR inhibitörleri bo'lgan yuqori qatlam olib tashlanadi. Uskunani keyingi yuvish ketma-ketligi yuqori darajada tozalangan NK preparatini ishlab chiqaradi. Hozirgi vaqtda sorbent usulining tegishli modifikatsiyasi - izolyatsiya magnit zarrachalarda qo'lda yoki avtomatik rejimlarda. Sehrgarni ishlatish nite qattiq tashuvchilar magnit bo'lmaganlarga nisbatan bir qator afzalliklarga ega ajratish usullari.

Izolyatsiya jarayoni uchun magnit tashuvchilar ishlatiladi (sintetik limerlar, biopolimerlar, g'ovakli shisha, yuzasi o'zgartirilgan temir oksidi va boshqa) o'ziga xos nuklein kislotaga yuqori yaqinligi bilan ajralib turadi. An'anaviy ammo magnit zarrachalar bo'lishi uchun namunani o'z ichiga olgan probirkaning devoriga qo'llaniladi devorga birlashtirilib, qolgan namunani olib tashlash mumkin edi. Shu tarzda, siz qila olasiz ammo DNK polimerazasini inhibe qiladigan hujayra lizatining tarkibiy qismlarini ajratish uchun va PCR. Bunday holda, DNKni ham, RNKni ham yuqori mahsuldorlik bilan ajratib olish mumkin muhim miqdordagi aralashmalarni o'z ichiga olgan namunalardan. Umuman olganda, sorbent usullari nuklein kislotaning yuqori darajada tozalanishini ta'minlaydi kislotalar, ammo yo'qotishlar bilan bog'liq bo'lishi mumkin (ayniqsa tarkibida past bo'lgan taqdirda) namunada - "past nusxadagi namuna") tashuvchida qaytarilmas sorbsiya tufayli yoki bir nechta yuvish paytida. Bundan tashqari, sorbentning qoldiq miqdori oxirgi eritmada DNK fermentativ PCR reaktsiyalarini inhibe qilishi mumkin.

3. Alkogolli yog'inlar (yog'ingarchilik) - NK ning birlashishi (ham DNK, ham RNK) tuz va spirtli ichimliklar mavjud bo'lganda. Spirtli ichimliklar bilan yog'ingarchilikdan so'ng, NC eritmadan ajralib chiqadi santrifüj. NK nishonini o'z ichiga olgan cho'kma bir necha marta yuviladi spirtli ichimliklar bilan va santrifüj bilan konsentrlangan. Yakuniy bosqichda, ko'pincha isitish vaqtida suvning tamponida NA ning erishi Cho'kma yaxshiroq erishi uchun 55-65 ° S gacha. Ushbu texnologiyaning afzalligi "kompleks" bilan ishlash qobiliyatidir mi "namunalari, ham DNK, ham RNKni ajratib turadi, lekin spirtli ichimliklarni yog'ingarchilik nafaqat NK, balki oqsillarni ham yog'inlanishiga olib keladi, bu esa o'z navbatida toza preparatni olishni qiyinlashtiradi. Sinovni hal qilishning eng oddiy usuli kiruvchi aralashmalar bilan lemlar - bu tahlil qilinadigan hajmning pasayishi th namunasi, ammo natijaga erishish kerak bo'lsa, ushbu yondashuv qo'llanilmaydi maksimal sezgirlik bilan. Izolyatsiya jarayonining sifatini ta'minlash uchun nafaqat "murakkab" ni hisobga olish muhimdir ness "tadqiqotlari uchun material va shunga asoslanib, eng samarasini tanlang tive ekstraksiya usuli, shuningdek maqsadli nuklein kislotasining xususiyatlari. DNK ancha barqaror substrat bo'lib, uning ostida sekinroq parchalanadi DNase ta'sirida u namunani tashish va saqlash paytida yaxshiroq saqlanadi va katta bug 'yordamida uzoq muddatli izolyatsiya texnikasidan foydalanishga imkon beradi tii namunalari. Aksincha, RNK beqaror mahsulot bo'lib, sharoitda osongina parchalanadi maxsus stabillashmasdan uzoq muddatli tashish va saqlash ijtimoiy muhit. Qo'lda ekstraksiya usullari sharoitida izolyatsiya stabillashmagan RNK eng kichik qismlarda amalga oshiriladi, masalan, degradatsiyani oldini olish uchun PCR santrifüjlar laboratoriyasida mavjud bo'lgan konteynerdan olingan choralar rnA yuvish va santrifüj bosqichlari orasidagi intervallarda. Shunday qilib, PCR uchun namunalarni tayyorlash usulini tanlashga yaqinlashish kerak tavsiya etilgan tahlillarning maqsadlari va materialning xususiyatlarini tushunish bilan tadqiqot uchun