Структура и функции белков и пептидов

 
Изоэлектрофокусирование
 
Метод основан на различной величине ИЭТ белков. 
Белки разделяют методом электрофореза на пластине с амфо-
лином (это вещество, у которого заранее сформирован гради-
ент pH в диапазоне от 3 до 10). При электрофорезе белки раз-
деляются в соответствии со значением их ИЭТ (в ИЭТ заряд 
белка будет равен нулю, и он не будет передвигаться в элек-
трическом поле). 
Двухмерный электрофорез 
Представляет собой сочетание изоэлектрофокусирования и электрофореза с ДДС-Na. 
Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении на пластине с амфолином. 
Белки разделяются в зависимости от заряда (ИЭТ). Затем обрабатывают пластину раствором 
ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном направлении. Белки разделяются в зави-
симости от молекулярной массы.
 
Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот) 
Аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце 
(рис 2.4).
 
Этапы: 
А. 
Б 
В 
Г 
Д 
Условные
обозначения: 
Интересующий 
белок 
Лиганд 
Лиганд, связанный
с частицей полимер-
ного сорбента 
А. 
Б 
В 
Г 
Д 
Условные
обозначения: 
Интересующий 
белок 
Лиганд 
Лиганд, связанный
с частицей полимер-
ного сорбента 

---

15 
1.
Выделение белков из биологического материала. 
2.
Разделение белков по молекулярной массе методом электрофореза в ПААГ с 
ДДС-Na. 
3.
Перенос белков с геля на полимерную пластину с целью облегчения дальнейших 
работ. 
4.
Обработка пластины раствором неспецифического белка для заполнения остав-
шихся пор.
Таким образом, после этого этапа получена пластинка, в порах которой содержатся раз-
деленные белки, а пространство между ними заполнено неспецифическим белком. Теперь 
надо выявить, есть ли среди белков искомый, ответственный за какое-то заболевание. Для 
выявления используют обработку антителами. Под первичными антителами понимают анти-
тела к искомому белку. Под вторичными антителами понимают антитела к первичным анти-
телам. В состав вторичных антител вводят дополнительно специальную метку (т.н. молеку-
лярный зонд), чтобы потом можно было визуализировать результаты. В качестве метки ис-
пользуются радиоактивный фосфат или фермент, прочно связанные с вторичным антителом. 
Связывание сначала с первичными, а затем с вторичными антителами преследует две цели: 
стандартизация метода и улучшение результатов. 
5.
Обработка раствором первичных антител 

связывание происходит в том месте 
пластины, где есть антиген (искомый белок). 
6.
Удаление несвязавшихся антител (промывка). 
7.
Обработка раствором меченых вторичных антител для последующей проявки. 
8.
Удаление несвязавшихся вторичных антител (промывка). 
9.
Проявка — авторадиография в случае использования радиоактивного фосфата 
или обработка пластины раствором субстрата — в случае ферментной метки. 
 
Рис. 2.4
. Иммуноэлектрофорез (Вестерн-блот) 
В случае присутствия искомого белка в биологическом материале – на пластинке по-
является полоса, свидетельствующая о связывании этого белка с соответствующими антите-
лами.