O„zbekiston respublikasi oliy va o„rta

Taqsimlanish (qog‟oz) xromatografiyasi

Taqsimlanish xromatografiyasi ikki (qo‘zg‘aluvchan va qo‘zg‘almas) faza orasida moddaning tinmay qayta taqsimlanish jarayoniga asoslangan.

Agar qo‘zg‘almas faza nisbatan polyar bo‘lsa, taqsimlanish koeffitsientining ortib borishi moddaning siljishini kamayishiga olib keladi. Qo‘zg‘aluvchan faza suyuq bo‘lsa, xromatografik ajratish jarayoni kolonkada, qog‘ozda va yupqa qatlamli sorbentlarda olib boriladi.
Qog‘ozda taqsimlanish xromatografiyasi moddalarning o‘zaro aralashmaydigan ikki suyuqlik orasidagi taqsimlanish koeffitsientlarining turlicha bo‘lishiga asoslangan. Bunda suyuqliklardan bin qog‘oz bo‘ylab sekin tarqalsa (qo‘zg‘aluvchan faza) ikkinchisi esa qo‘zg‘almas faza bo‘lib xizmat qiladi. Qo‘zg‘aluvchan faza tekshirilayotgan aralashmani o‘zida eritib birgalikda qog‘oz bo‘ylab siljitadi va uning joyini o‘zgartiradi.
Xromatografiyalash jarayonida qo‘zg‘aluvchan va qo‘zg‘almas fazalar orasida moddaning juda ko‘p marotaba qayta taqsimlanish jarayoni sodir bo‘ladi. Moddaning qog‘ozda siljish tezligi uning taqsimlanish koeffitsientiga bog‘liq. Taqsimlanish koeffitsienti esa tekshirilayotgan moddaning ikki fazada qanday erishiga bog‘liq bo‘lib, moddaning qo‘zg‘almas fazadagi konsentratsiyasining S₁, qo‘zg‘aluvchan. fazadagi konsentratsiyasiga S₂ nisbati bilan belgilanadi.
Agar qog‘ozga 2 modda aralashmasi tomizilgan bo‘lsa-yu, ulardan birining taqsimlanish koeffitsiyenti ikkinchisinikidan yuqori bo‘lsa. unda xromatografiyalash jarayonida birinchi modda ikkinchisiga qaraganda qog‘ozda sekin siljiydi va natijada xromatogrammada ular ikki xil joyni egallaydi. Moddalarning qog‘oz bo‘ylab tarqalish xususiyati ularning R_f kattaligi bilan belgilanadi. R_f deb start chizig‘idan xromatogrammadagi modda hosil qilgan dog‘ning markazigacha masofa (a) va start chizig‘idan erituvchilar aralashmasining front chizig‘igacha bo‘lgan masofa (b) lar nisbatiga aytiladi:

f
R  a / b
Moddalarning R_f qiymati turli omillarga: erituvchining xususiyatiga, tarkibning tozaligiga, modda miqdoriga, xromatografiyalash harorat- iga, qog‘ozning turiga va boshqalarga bog‘liq.
Ba‘zida R_r o‘miga R_s qiymati ishlatiladi. R_s bu start chizig‘idan xromatogrammada hosil bo‘lgan tekshiriluvchi dog‘ markazigacha bo‘lgan masofa — a va start chizig‘idan standart moddaning dog‘i markazigacha bo‘lgan

• 
  a₀ masofalar yoki tekshirilayotgan va standart modda R_r qiymatlari nisbatidir. Bunda R_s qiymati 0,5—2 oralig‘ida bo‘lishi kerak.
  

Xromatografiyalash ―xromatografiya uchun‖ maxsus qog‘ozlarda olib boriladi. Ular turlicha bo‘ladi: tez, sekin, o‘rtacha va filtrlovchi qog‘ozlar. Qog‘ozlar ba‘zida xromatografiyalashdan oldin maxsus ishlov berish orqali tozalanadi, lekin ko‘pincha bu talab etilmaydi.
Xromatografiyalash uchun ishlatiladigan erituvchilar toza bo‘lishi, o‘zaro va tekshirilayotgan modda bilan reaksiyaga kirishmasligi kerak. Qog‘oz gidrofil xususiyatga ega bo‘lgani uchun qo‘zg‘almas faza sifatida ko‘pincha nisbatan polyar erituvchilar aralashmasi ishlatiladi. Agar xromatografiyalashdan oldin qog‘oz maxsus ishlanib, unga gidrofob xususiyat berilgan bo‘lsa, polyarligi kam bo‘lgan erituvchi ishlatiladi.
Erituvchilami tanlash aniqlanuvchi moddalar xususiyatlariga bog‘liq bo‘lib, kuchli polyar moddalar uchun qo‘zg‘almas fazasi tarkibida suv bo‘lgan
erituvchilar aralashmasi, o‘rtacha polyar moddalar uchun esa qaynash harorati yuqori bo‘lgan organik erituvchilardan (formamid, propilenglikol, atsetonitril va boshqalar) iborat bo‘lgan qo‘zg‘almas fazadan foydalaniladi.
Bir xil qo‘zg‘almas fazali aralashmalarda qo‘zg‘aluvchan fazaning polyarligi oshib borishi xromatografiyalanayotgan modda siljishining tezlashishiga olib keladi. Asos xossali moddalarni ajratish uchun ko‘pincha quyidagi erituvchilar aralashmasidan foydalaniladi:
1 .a) N-butil spirti-bufer eritma pH=3,0;
b) N-butil spirti-bufer eritma pH =5,0;

4. 
   N-butil spirti-bufer eritma pH =6,5;
   
5. 
   N-butil spirti-bufer eritma pH =7,5;
   

2. a) formamid +1% li sirka kislotasi/xloroform
b) metil spirti—5% li ammiak—benzol 2:1:1;

4. 
   N-butil spirti—sirka kislotasi—suv 4:1:5;
   
5. 
   formamid/xlorofrm;
   
6. 
   formamid/xloroform—benzol 1:1;
   
7. 
   formamid/benzol;
   
8. 
   formamid/benzol—benzin 1:1.
   

Quyi alifatik kislotalar uchun kerosin yoki vazelin moyi — 90% sirka kislotasi aralashmasi ishlatiladi. Steroidlami ajratishda yuqorida ko‘rsatilgan hamma erituvchilar aralashmasidan foydalanish mumkin. Masalan, kortizon atsetat, prednizon, prednizolonlar uchun formamid ishlatiladi.
Xromatogrammada hosil bo‘lgan dog‘lar ultrabinafsha yoki ko‘zga ko‘rinadigan nurda ko‘riladi hamda xromatogrammaga turli ochuvchi reaktivlar eritmasidan purkash yordamida aniqlanadi. Ba‘zi dog‘lar UB- nurda tovlanadi yoki o‘ziga xos rangga ega bo‘ladi. Hozirgi vaqtda xroma- togrammalami ma‘lum ozuqa muhitga joylashtirilib, bakteriyalarning o‘sishini kamayishi yoki ko‘payishiga qarab ham aniqlanmoqda. Keyin- chalik ularning R_r qiymatlari hisoblanadi.
Qog‘oz xromatografiyasi olib borish usuliga ko‘ra quyidagi turlarga bo‘linadi: pastga qarab, yuqoriga qarab, aylana ko‘rinishlarida. Pastga qarab olib boriladigan xromatografiyada erituvchi, shuningdek unda erigan modda yuqoridan pastga qarab harakat qiladi. Yuqoriga qarab olib boriladigan xromatografiyada esa, aksincha, pastdan yuqoriga qarab harakatlanadi.
Aylana (radial) xromatografiyada erituvchi va unda erigan modda qog‘ozning markazidan radius bo‘yicha chetiga qarab siljiydi. Yuqorida aytib o‘tilgan uslublardan tashqari yana qayta va ikki o‘lchamli xromo- tografiyalash turlari ham mavjud. Ikki o‘lchamli xromatografiyalashda moddalarni ajratish ikki tomonlama, ya‘ni birinchi safar bir tomonga bo‘lsa, ikkinchi martasida oldingisiga perpendikular tomonga qarab olib boriladi.
Qayta xromatografiyalashda ajratish jarayoni 2 marta bir tomonga qarab takrorlanadi. Xromatografiyalash jarayoni og‘zi yaxshi yopiladigan shisha idishlarda (banka, silindr va boshqalar) olib boriladi.
Pastga qarab xromatografiyalashda shisha kamera ichiga qo‘zg‘aluvchan faza ma‘lum balandlikdagi moslamaga solish uchun mo‘ljallangan idishga
joylashtiriladi. Yuqoriga qarab xromatografiyalashda esa qo‘zg‘aluvchan faza solingan idish kameraning tagiga joylashtiriladi. Tepasiga esa xromatografiya qog‘ozini mahkamlash uchun moslama biriktiriladi.
Aylanali xromatografiyalashda eksikatordan yoki Petri kosachasidan foydalaniladi. Agar qo‘zg‘almas faza sifatida suv ishlatilsa, u kameraga quyiladi, boshqa yuqori haroratda qaynovchi, uchmaydigan erituvchi (formamid) bo‘lsa, unda qog‘oz shu erituvchining suyultirilgan eritmasi bilan shimdiriladi, idishga esa qo‘zg‘aluvchan faza solinadi. Kameralarni erituvchilar aralashmasi bilan yaxshilab to‘yintirish maqsadida ko‘pincha erituvchiga tegib turadigan qilib kameraning chetlariga filtr qog‘oz yopishtiriladi.
Qog‘oz xromatografiyasi quyidagi tartibda olib boriladi:

1. 
   Qog‘oz va erituvchilami tayyorlash.
   
2. 
   Tekshirilayotgan moddalarning eritmasini tomizish.
   
3. 
   Tekshirilayotgan moddani ajratish — xromatografiyalash.
   
4. 
   Xromatogrammadagi moddalami ochish.
   

Erituvchilar aralashmasini tayyorlashda ikki aralashmavdigan erituvchilar (qo‘zg‘almas va qo‘zg‘aluvchan fazalar) bir-biriga to‘yingan bo‘lishi kerak. Bunday to‘yintirish ajratuvchi voronkalarda chayqatish yordamida olib boriladi. Masalan, N-butil spirti-suv-sirka kislotasi aralashmasi yaxshilab chayqatiladi, tinishi va 2 qatlamga bo‘linishi uchun ma‘lum vaqtga qoldiriladi. Aralashmaning yuqori qatlami qo‘zg‘aluvchan, pastkisi esa qo‘zg‘almas faza sifatida ishlatiladi. Maxsus xromatografik qog‘ozdan tegishli o‘lchamda (xromatografiya kolonkasining katta-kichikligiga, moddalarning qog‘ozda taqsimlanib joylashish masofasi, tahlil qilinayotgan eritma tarkibidagi moddaning soni e‘tiborga olinib) kesib olinadi. Yuqori va pastga qarab olib boriladigan xromatografiyalashda qog‘oz to‘g‘ri burchakli qilib kesiladi va pastki qismidan 2—3 sm yuqorida
―start‖ chizig‘i chiziladi. Namuna start chizig‘iga qog‘oz chetidan va boshqa na- munalardan 2 sm masofada tomizg‘ich (kapillyar) yordamida tomiziladi va yaxshilab quritiladi.
Aylanali xromatografiyalashda qog‘ozning markazi teshiladi, unga dumaloq qilib o‘ralgan filtr qog‘oz joylashtiriladi. Bunda start chizig‘i sifatida o‘rtasida D=2—3 sm masofada chizilgan aylana xizmat qiladi.
Namuna hajmi 0,1—0,2 ml (bo‘linish belgisi 0,001—0,002ml) bo‘lgan tomizg‘ichlarda yoki maxsus avtomatik mikropipetkalarda tomiziladi. Bunday pipetkalardan ko‘pincha miqdoriy tahlil o‘tkazilayotganda foydalaniladi, sifat tahlilni o‘tkazishda oddiy kapillyardan foydalanish ham mumkin. Tomizilgan namuna dog‘ining kattaligi 6—10 mm dan oshmasligi kerak, shuning uchun namuna juda kam miqdorda tomiziladi. Namunaning miqdori 0,1 dan 100 mkg gacha bo‘lishi mumkin va u turli omillarga (yot moddalar soni va miqdoriga, ochuvchi moddaga, yot moddaning sezgirligi, asosiy va yot modda R₍. qiymatlari o‘rtasidagi farqqa, dog‘larning shakliga) bog‘liq. Namuna tomizilgan qog‘oz quritiladi va pastki qismi kameradagi maxsus tayyorlangan erituvchilar aralash- masiga tegib turadigan qilib (2—3 sm) kameraga tushiriladi. Aylanali xromatografiyalashda qo‘zg‘aluvchan fazaga tushirilgan qog‘ozning pastki qismi erituvchiga tegib turishi kerak. Erituvchi qog‘oz yuqorisiga yetganida (taxminan
10—15 sm ko‘tarilganda), qog‘oz kameradan olinadi va erituvchi yetib borgan chegara (front) qalam bilan belgilab qo‘yiladi. Xromatogramma quritiladi va UB- nur oqimida ko‘riladi yoki tahlil qilinayotgan moddaga xos bo‘lgan reaktiv eritmasi bilan purkaladi. Purkash purkagich yordamida yoki xromatogrammani reaktiv bilan xo‘llash orqali olib boriladi. Reaktiv eritmasining ortiqchasi toza suv bilan yuvib yo‘qotiladi. Xromatogrammadagi dog‘larning chegaralari belgilanadi, quritiladi va R. qiymati hisoblanadi.
Qog‘ozda taqsimlanish xromatografiyasi usuli dori moddalarning chinligi, tozaligi va miqdorini aniqlashda qo‘llaniladi.
Moddalarning chinligini va tozaligini aniqlashda R_r qiymatlaridan, yanada aniq natija olish uchun standart namunalardan foydalaniladi (―guvoh‖ moddalar). Buning uchun tekshirilayotgan eritma tomizilgan joydan 1,5—2 sm oraliqdagi tahlil qilinayotgan aralashma tarkibida bor deb taxmin qilinayotgan toza modda eritmasidan bir necha tomchi tomiziladi va xromatografiyalashdan so‘ng dog‘larning joylashishi, rangi va R_r qiymatlari bo‘yicha solishtiriladi.
Dori moddalar tozaligini tekshirishda xromatogrammada tekshiriluvchi modda va uning tarkibidagi yot modda turlicha R_r qiymatga ega bo‘lishi kerak. Xromatogrammadagi dog‘larning soniga va ularning R, qiymatlariga qarab yot moddalar borligi haqida xulosa chiqarish mumkin.
Dori moddalarning miqdoriy tahlilini olib borishda qog‘ozdagi start chizig‘ining bir necha joyiga (2 sm oraliqda) aniq miqdordagi namuna tomiziladi va xromatografiyalanadi. Xromatogramma UB-nurlari oqimida ko‘riladi yoki bir qismi purkalmagan joyidan qog‘ozning purkalgan qismidagi dog‘ga mos ravishda kesim kesib olinadi. Kesilgan qog‘oz kolbaga solinadi va modda qog‘ozdan tegishli erituvchi yordamida yuvib olinadi (elyuatsiya). Elyuat tarkibidagi modda konsentratsiyasi tegishli usulda (SF, FEK, polyarografik usullar) aniqlanadi. Usulning xatoligini kamaytirish maqsadida qog‘ozning aniqlanayotgan dog‘ga mos keladigan joyidan dog‘ kattaligida kesib olinadi, elyuatsiya qilinadi va solishtiriluvchi eritma sifatida ishlatiladi.
Xromatogrammadagi tekshirilayotgan modda konsentratsiyasini elyuatsiya qilmasdan turib ham aniqlash mumkin (densitometrik usul).
Aniqlash tartibi:
lttikanak (chereda) yer ustki qismi tarkibidagi flavonoidlami aniqlash uchun 25 ml hajmli og‘zi mahkam berkiladigan kolbaga 0,5 g maydalangan o‘simlik xom ashyosi solinib, 5 ml 70% li spirt quyiladi va kolba vertikal sovitgichga ulanib 20 minut davomida suv hammomida qaynatiladi. Ajratma xona haroratigacha sovitilib, qog‘oz filtr orqali filtrlanadi (B eritma).
Mikropipetka yordamida FN 12 markali xromatografiya qog‘oziga 0,02 ml V eritmadan tomizib, quritilgach, n-butil-spirti-sirka-kislotasi-suv (4:1:2) erituvchilar aralashmasi solib 24 soat davomida to‘yintirilgan kameraga joylashtiriladi va xona haroratida 16 soat davomida xromatografiyalanadi. Xromatogrammani kameradan olib, xona haroratida quritib, 360 nm to‘lqin uzunligida UB-nurda ko‘riladi.
Xromatogrammada R_f=0,38 va R_f=0,58 bo‘lgan to‘q jigar rangda tovlanuvchi dog‘lar (fiavonoidlar) bo‘lishi va R=0,78 bo‘lgan dog‘ kuzatilmasligi
kerak (yot aralashma).

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (yuqori bosim suyuqlik xromatografiyasi)

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi suyuqlik xromatografiyasi usulining bir ko‘rinishi bo‘lib, bunda qo‘zg‘aluvchan faza - elyuyent kolonkadagi sorbentdan katta tezlikda yuqori bosim ostida o‘tadi. Usul yuqori va quyi molekulali issiqlikka chidamsiz moddalarni ajratib olishga, ularning chinligini va miqdorini aniqlashga imkon beradi.

Hozirgi zamon xromatografiyalari quyidagi qismlardan tashkil topgan: yuqori samarali kolonka, dozator, yuqori bosimli nasos, yozuv qurilmali detektor, mikroprotsessor (31-rasm). Xromatograflar, shuningdek namunalami avtomatik ravishda kolonkaga yuborish, reja asosida xromatografiyalash muhitini ushlab turish, ajratish jarayonining qulay sharoitini avtomatik tanlab berish, tahlil qilinayotgan aralashma tarkibidagi moddalarning chinligi va miqdorini aniqlab beruvchi moslamalar bilan ta‘minlangan.
Yuqori bosimli nasos (200—500 atm gacha) elyuyentni berilgan doimiy tezlikda kolonkaga yetkazib beradi. Ba‘zida mikrokolonkali xromatograflarda nisbatan past bosimli nasoslar qo‘llaniladi (1—20 atm gacha). Xromatografik kolonkalar zanglamaydigan po‘lat (yoki shisha)dan tayyorlangan bo‘lib, uzunligi 10-25 sm, ichki diametri 0,3—0,8 sm (ko‘pincha 0,4-0,5 sm) ga teng. Kolonkalar diametri 5-10 mkm bo‘lgan dumaloq yoki notekis shakldagi adsorbent bilan yuqori bosimda suspenzion usul yordamida to‘ldiriladi. Suspenzion usul bilan to‘ldirilganda sorbent kolonkada bir tekis bo‘lib zich joylashadi. Mikrokolonkali xromatograflarda kolonka- larning uzunligi va ichki diametri kichik bo‘ladi (0,1—0,2 sm va undan ham kichik).
Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida qo‘llaniladigan adsorbent zarrachalari yuqori bosim ostida parchalanmasligi kerak. Zich joylashgan kichik diametrli (5-10 mkm) adsorbent bilan to‘ldirilgan kolonkalar aralashmalami yuqori samarali xromatografik taqsimlash xususiyatiga ega. Xromatografiyalash jarayoni ketayotgan vaqtda kolonka harorati ±0,1⁰C aniqlikda ushlab turiladi. Xromatografik taqsimlanish ko‘pincha 20—25⁰ da olib boriladi.
Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida ko‘pincha refraktometrik yoki flyuorimetrik, to‘lqin uzunligi o‘zgaruvchan (190—900 nm) yoki o‘zgarmaydigan (ko‘pincha 254 nm) spektrofotometrik, shuningdek, alanga- ionlanish, elektro-kimyoviy, mass-spektrometrik va boshqa detektorlar ishlatiladi. Adsorbent sifatida ko‘pincha gidroksil guruhlar bilan qoplangan silikagel,
turli funksional guruhlar bilan ishlangan silikagel, aluminiy oksidi, polimerlar, amaliyotda esa tayyor kolonkalar ishlatiladi. Silikagel bilan to‘ldirilgan kolonkalar bilan ishlashda elyuyent sifatida uglevodorodlar, ba‘zida esa turli erituvchilar yoki spirt bilan aralashtirilgan uglevo- dorodlardan foydalaniladi.
Gidrofob guruhlar bilan qoplangan silikagel bilan to‘ldirilgan kolonkalarni yuvishda esa tarkibida quyi spirtlar yoki atsetonitril bo‘lgan suvli eritmalar ishlatiladi. Ba‘zida erituvchilar ikki marta tozalangan bo‘lishi kerak. Tuz, kislota
va asos ko‘rinishidagi organik birikmalarni ajratishda juft-ion xromatografik usuldan foydalaniladi. Bunda gidrofob guruhlar bilan qoplangan silikagel adsorbenti. anion yoki kation tarkibida gidrofob guruh saqlovchi ionli birikmalar qo‘shilgan suv-spirtli yoki suv- atsetonitrilli elyuyentlar ishlatiladi.
Organik tuzilishga ega bo‘lgan anion va kationlarni ion-almashinish suyuqlik xromatografiyasi yordamida ajratiladi. Adsorbentlar sulfo-, karboksil yoki aminoguruhlar bilan qoplangan bo‘lishi kerak. Elyuyent sifatida ma‘lum rN muhitga va ion kuchiga ega bo‘lgan suvli bufer eritmalar ishlatiladi.
Metal kationlari bilan kompleks hosil qiluvchi moddalarni ajratishda ligand almashinish xromatografiyasi usulidan foydalaniladi. Taqsimlanish yoki moddalarning ajralishi tekshirilayotgan birikmalarning koordinatsion bog‘lar hosil qilish xususiyatlari o‘rtasidagi farqqa asoslangan bo‘lib, ko‘incha aminokislotalarning izomerlari tahlil qilinadi. Adsorbentlar metal ionlari va ajralayotgan modda bilan kompleks birikmalar hosil qiluvchi guruhlar bilan qoplangan bo‘ladi.
Moddalarning ajralish darajasi xromatogrammadagi ikki qo‘shni cho‘qqilarning balandliklari o‘rtasidagi masofa va xromatografik chizmaning kengligi bo‘yicha aniqlanadi. Cho‘qqilar balandligi o‘rtasidagi masofa aniqlanuvchi moddaga nisbatan adsorbentning selektivligiga, kengligi esa adsorbentning joylashishiga va elyuyentning quyuqlik darajasiga bog‘liq. Yuqori samarali kolonka adsorbentning selektivligi kichik bo‘lsa ham moddalarni ajratib berish xususiyatiga ega.
Moddalar miqdorini aniqlashda xromatogramma mutlaq kalibrlash yoki ichki standartlar (gaz xromatografiyasi usuli kabi) usullari yordamida tahlil qilinadi. Yot moddalar xromatogrammadagi cho‘qqilarni solishtirish bo‘yicha aniqlanadi. Bir hil muhitda moddaning kolonkadan chiqish vaqti bir xil va doimiy bo‘ladi va bu xususiyatdan aniqlanuvchi birikmaning chinligini aniqlashda foydalaniladi. Miqdoriy tahlilda cho‘qqilar yuzalari hisoblanadi, chunki cho‘qqi yuzasi moddaning miqdoriga to‘g‘ri mutanosib.