O`sririlgan hujuralar va ularning turlari

O`sririlgan hujuralar va ularning turlari

Birlamchi – tripsinda ishlov berilgan hujayralar
Organ yoki to‘qimalardan olingan faqat bir qavat bo‘lib o‘sayotgan hujayralardir. O‘stirilgan hujayralarni xoxlagan hayvon yoki odam organidan yoki to‘qimasidan (homilasidan) tayyorlash mumkin. Iloji boricha homila to‘qimalaridan yoki organlardan tayyorlansa, hujayralarning o‘sish imkoniyati kuchli bo‘ladi. Shuning uchun ko‘pincha, yosh hayvonlardan buyrak, o‘pka, teri, timus, homilaning testikulalari olib ishlatiladi. Birlamchi hujayrani olish uchun sog‘lom hayvon so‘yilgandan so‘ng 2-3 soat o‘tar-o‘tmas tegishli organ va to‘qimalari olinib kattaligi 1-4 mm gacha maydalanadi va tripsin, pankreatin, kollogenaza fermenti bilan ishlov beriladi.
Fermentlar hujayra oralig‘idagi moddalarni buzib hujayralarni yakka holga keltiradi. Yakka holdagi hujayralarni oziq muhitga solinib 37⁰C o‘stirishga qo‘yiladi. Hujayralar probirka va matras devorlariga yopishgan holda bo‘lina boshlaydi.
Hujayraning o‘sish davri bir necha fazalardan iborat: adaptatsiya, logarifmik o‘sish statsionardagi va hujayraning eskirishi tufayli o‘lishi. Hujayra o‘sish davrida shishaning butun borlig‘ini yopib olgandan so‘ng bir-biriga tegishi natijasida bo‘linishdan to‘xtaydi. Idish ichida bir hujayra qalinligida qavat hosil bo‘lib, bunga bir qavatli o‘sish deyiladi. (36-38 rasmlar).
Oziq muhiti hujayraning yashovchanlik vaqtida ajratib chiqargan mahsulotlar bilan ifloslanishi hisobga olinib, almashtirib turiladi. Bir qavatli o‘sish o‘zining yashovchanligini 7-21 kun davomida saqlab turadi. Viruslarni o‘stirish uchun yosh o‘stirilgan hujayralar ishlatiladi.
S
36-rasm. Mikrotashigichda hujayrani o‘stirish.

ubkulturalar - virusologiya amaliyotida birlamchi hujayralar o‘stirilgan matraslarning shisha devoridan tripsin va versen yordamida ajratib olinadi va oziq muhitida qaytadan suyultirilib boshqa matras yoki probirkalarga ko‘chirib ekiladi. 2-3 sutka mobaynida bir qavatli hujayra hosil bo‘ladi.
Amaliyotda subkulturalar birlamchi o‘sti-rilgan hujayralardan olinadi. Subkulturalar viruslarga sezgirligi jihatidan birlamchi o‘stirilgandan qolishmaydi, undan tashqari ular tejamli bo‘lib, hujayralarni virus bilan kontaminatsiyalashi mumkin. Sub-kul’turalar 2-5 passajdan keyin ayrim holda 8-10 passajdan so‘ng olinadi.
Keyinchalik passaj qilish natijasida hujayraning shakli o‘zgarishi va so‘ngra o‘lishi mumkin. O‘stirilgan hujayralar 10 marta passaj qilingandan so‘ng chirmashib o‘suvchi to‘qimalarga o‘tish bosqichida bo‘ladi.


37-rasm.Qo‘y homilasining o‘pkasidan tayyorlangan birlamchi o‘stirilgan hujayra.



38-rasm. Buqaning testikulasidan tayyorlangan
birlamchi o‘stirilgan hujayra.

2.Chirmashib o‘suvchi to‘qima kultu’ralari - Bu hujayralar organizmdan tashqarida uzoq muddatgacha ko‘payish qobiliyatiga ega.laboratoriya sharoitida ularni saqlash uchun bir idishdan ikkinchi idishga ko‘chirib ekish tufayli saqlab, oziq muhit har doim yangisiga almashtirib turiladi.
O‘sishda yuqori aktivlikka ega bo‘lgan, ma’lum bir tartibda uzoq muddat ko‘chirib o‘tkazilgan birlamchi o‘stirilgan hujayralardan chirmashib o‘suvchi to‘qima kul’turalari tayyorlanadi. Yangi hujayra qatoridagi chirmashib o‘suvchi to‘qima kul’turalarini kelib chiqish mexanizmini hujayraning genetik o‘zgarishi natijasida yoki ayrim hujayralarni seleksiyalanishida- birlamchi tayyorlangan hujayra tarkibida bor bo‘lgan hujayra deb tushuntiriladi.
Chirmashib o‘suvchi to‘qima bir xil shaklda bo‘lib, o‘sishi hatto ayrimlari onkogen aktivlikka ham ega. Chirmashib o‘suvchi to‘qimaning onkogen aktivlikka ega bo‘lish xususiyati, viruslarni o‘stirib vaksina tayyorlash vazifasini cheklaydi.
Chirmashib o‘suvchi to‘qima hujayralarini sog‘lom hayvonlar to‘qimasidan yoki zararli shish to‘qimalaridan tayyorlash mumkin. Bularning ichida quyidagi qatordagi hujayralar keng ishlatiladi:
Hela – (ayollar bachadonining bo‘yin qismi hujayrasidan, rak kasalligida);
Hep – 2 (odam qizil o‘ngachining kartsinomasida) (39 rasm);
KB – (og‘iz bo‘shlig‘ning rakida);
BNK – 21 (yangi tug‘ilgan xomyakchalar buyragida);
PPES – (perevivaemaya pochka embriona svin’i) cho‘chqa homilasining o‘suvchi buyragi;
PPT (perevivaemaya pochka telyonka) - chirmashib o‘suvchi cho‘chqa buyragi;
PPO (perevivaemaya pochka ovets) - chirmashib o‘suvchi qo‘y buyragi;
TR (iz slizistoy traxei korov) - sigir traxeyasining shilimshig‘i;
L (mishinie fibroblasti) - sichqon fibroblastlari;
COS (iz serdsa obezyani sinomolgus) - sinomol’gus maymunning yuragidan va boshqalar.
Chirmashib o‘suvchi emlanadigan hujayralarning bir qator afzallik tomonlari bor:
Ularni tayyorlash deyarli oddiy, mehnat va moddiy vositalar tejaladi;
Bu kul’turalarni oldindan latent virus yoki mikroflora borligiga tekshirish mumkin;
Klon liniyalari o‘sishi uchun standart sharoit bilan taminlaydi, birlamchi hujayralarda esa hujayralarning aralash populyatsiyasi mavjud.
Birlamchi kulturalarga nisbatan ko‘pchilik chirmashib o‘suvchi hujayralar viruslarga keng spektrda sezgir. Ammo chirmashib o‘suvchi hujayralarning kelib chiqishidan va viruslarga sezgirligining kamayishidan qat’iy nazar, zararli shish qatoridagi chirmashib o‘suvchi hujayralardan foydalanish zarur.
Chirmashib o‘suvchi hujayralarni har doim qayta ekib turish tufayli saqlab turiladi. Ko‘pchlik holda sentrifugasiz usuldan foydalaniladi.
Navbatdagi ko‘chirib ekish 2-3 kunlik kul’turani yaxshi qavatidan olish uchun oziq muhit to‘kib tashlangach, hujayra qavatini 35-37⁰C qizdirilgan 0,02% - versen eritmasi bilan yopiladi.
Versenni dispergiyalash ta’siri Mg^{+ +}, Ca^{+ +} ikki valentli kationlari hujayrani shishaga yopishishini yaxshilab, hujayraning butunligini ta’minlaydi.
Versen ta’sirida hujayralar yumaloqlanib, shisha devoridan ajrala boshlaydi. Hujayra yumaloqlangandan so‘ng 10-15 daqiqa o‘tgach versen quyib olinib, 1 litrli matrasda 10-15 ml 0,1 litrlida 2-3 ml qoldiriladi va 5-10 daqiqa vaqti-vaqti bilan chayqatilib tutib turiladi, so‘ngra bir oz miqdordagi oziq muhitdan solinadi.
Hujayra oziq muhitida aralashtirilgach, Goryaev to‘rida sanaladi. 1 ml 80-200 ming miqdordagi hujayra oziq muhit bilan aralashtirilib, probirka va matraslarga quyilib rezina tiqin bilan yopiladi, so‘ngra 37⁰C 3-4 kun termostatda to‘lasincha bir qavat hujayra hosil bo‘lguncha o‘stirish uchun qo‘yiladi.
Ko‘pchilik holda Goryaev to‘rida hujayrani sanamasdan 1:2, 1:6 koeffitsientda ekiladi bu holda hujayraning turi inobatga olinadi.
Oziq muhitning tarkibi hujayraning turiga bog‘liq bo‘lib, ko‘pincha chirmashib o‘suvchi hujayrani o‘stirish uchun Igla muhiti, 199 yoki gidrolizat laktalbuminidan foydalaniladi.
Chirmashib o‘suvchi hujayralarni tartibli ravishda qaytadan ekish uchun laboratoriyada bir matrasni doimo saqlab turilib, avvalgi ekish yaroqsiz bo‘lgan holda hujayrani ushbu matrasdan olib ekiladi.
3.Diploidli hujayra kulturasi - Hujayra kulturasi bo‘yicha xalqaro komitet diploidli hujayralarni quyidagicha ta’riflaydi – hujayra populyatsiyasi morfologik bir xil bo‘lgan in vitro - o‘stirish jarayoniga moslashgan, cheklangan hayotiychanlikka ega, uch fazada o‘sishi, passaj natijasida kariotipni saqlab qoluvchi, olingan to‘qimaga o‘xshash kontaminantlardan ozod va xomyakchalarda transplantatsiyalashda tumorogen aktivlikka ega bo‘lmagan hujayralardir.
Diploidli hujayra kul’turasini ham chirmashib o‘suvchi hujayralardek, birlamchi o‘stirilgan hujayradan olinadi. Hujayra kariotipi juda labil bo‘lib, oddiy usullarda o‘stirilganda birinchi kundanoq o‘zgaradi. Shuning uchun to‘qimaga ishlov berishda maxsus usullardan foydalanish talab qilinadi.
Diploid holatida in vitro hujayrani uzoq vaqt saqlab turish uchun yuqori sifatga ega bo‘lgan oziq muhitlardan foydalaniladi.
Bu vazifani amerikalik olimlar Xeyflik va Murxed (1961) birinchi bo‘lib muvaffaqiyatli echdilar. Diploidli hujayralar (o‘pka, buyrak, teri-muskul to‘qimasi, yurak va boshqalar) odam homilasining har xil to‘qimalaridan olingan bo‘lib, yirik shoxli hayvon homilasining buyragidan, cho‘chqa, BHK-21 xomyakchalarning buyragi va boshqalardan tayyorlanadi.
Diploid hujayralarni chirmashib o‘suvchi hujayralardan farqi shuki ularda passaj qilish cheklangan.
Maksimal passaj qilish soni 50±10 bo‘lib so‘ngra bo‘linadigan hujayralar soni birdan kamayib, so‘ngra o‘ladi.
Ammo diploidli hujayralar uzoq muddat ishlatilishi mumkin, chunki har bir passajda hujayralarni qisman minus 196⁰C muzlatilib, kerak bo‘lgan taqdirda yana qaytadan tiklash mumkin. Diploidli hujayralarni chirmashib o‘suvchi va birlamchi hujayralarga nisbatan ustunligi bor:
Oziq muhitni almashtirganda ham ular 10-12 kun yashovchanlik holatini saqlab qoladi;
Haftada bir marta oziq mihit yangilanadi, 4 haftagacha yashovchanlik holatini saqlab turadi; shu to‘qimaga nisbatan sezgirligi saqlanib qolgan viruslasrni uzoq vaqtgacha o‘stirish uchun yaroqli hisoblanadi.
Suspenziyali hujayra kulturasi.
1953 yilda Ouens xodimlari bilan hujayraning suspenziyali holatda erkin ko‘payish xususiyatlarini ko‘rsatdi.
So‘ngi yillarda bu usul bir necha bor takomillashtirildi: mukammal belgilangan (harorat, pH, almashtirish tezligi) parametrli zamonaviy apparatlar ixtiro qilindi ko‘p liniyadagi chirmashib o‘suvchi hujayralar shu sharoitda BHK-21, Hep-2, MDBK ko‘payishga moslashtiriladi.
Suspenziyali kulturalarda viruslarning o‘stirilishi ishlab chiqarish sanoatida vaksina va diagnostikumlarni tayyorlash mumkinligini isbotladi.
Lekin faqatgina chirmashib o‘suvchi hujayralar suspenziyada yaxshi o‘sadi. Suspenziyada hujayralarni o‘stirish yangi yo‘nalish bo‘lib (sefadeks, silikagel, sitolar va boshqa) mikro tashigichlar ishlatila boshlandi. Mikrotashigichlarda o‘stirilayotgan hujayralar (monosloy) bir qavat hosil qiladi.
Shunday qilib suspenziyali o‘stirish usulida qattiq substratda yopishgan holda: birlamchi, subkultura, diploidli hujayralar parvarish qilinadi.
Bunday hujayralarni yuzaki-qaram bo‘lganlar deb atash qabul qilingan.
Mikrotashigichlarda o‘stirish uslubi hozirgi paytda juda ham mashxur bo‘lib hujayra, biotexnologiyasida, vaksina yoki boshqa biologik aktiv moddalar (interferon, gormonlar va boshq.) olishda katta yo‘nalishni tashkil etadi.
Nazorat uchun savollar
1. O‘stirilgan hujayralarning turlari to‘g‘risida gapiring va ularni ta’riflab bering.
2. O‘stirilgan hujayralarning yashovchanlik davri necha kun va u qanday omillarga bo‘liq?
3. O‘stirilgan hujayra kulturalari qanday sharoitda saqlanadi