Очистка белков методом гель-фильтрации

Оқсилларни гель-фильтрация усули билан тозалаш

Умумий маълумотлар

Гель-фильтрация нима?

Гель-фильтрация ёки эксклюзион хроматография (size exclusion) турли молекуляр оғирликка эга моддалар аралашмасини ҳар ҳил уяли геллар ёрдамида ажратиш услуби.

Гель-фильтрациянинг тарихидан: Суюқ аралашмаларни элакли тахлилда геллар(сефадекс)ни қўллаш даставвал 1959 й. Порат ва Флодинлар томонидан амалга оширилган.

Сувда эрийдиган макромолекулаларни, шу жумладан, оқсилларни молекуляр оғирлигига кўра сорбент орқали фракциялаш мумкинлиги кўрсатиб берилган. Сорбент сифатида полимерланган декстран гелидан фойдаланилган.

1964 йилда Д. Мур томонидан полимерларни молекуляр оғирликка асосланиб ажратишда стирол-дивинил бензол гелидан фойдаланишни таклиф қилди.

Ажратиш жараёни икки фаза орасида амалга оширилади. Уларнинг бири қаттиқ ва иккинчиси эса суюқ.

Ажратиш жараёни икки фаза орасида амалга оширилади. Уларнинг бири қаттиқ ва иккинчиси эса суюқ.

Қаттиқ харакатсиз (молекуляр элак) фаза сифатида ғовак шиша гранулалар ёки декстран (сефадекслар), полиакриамид (акрилекс, биогель Р), агарозалар (сефароза, биогельА, сагавак), полиакрилоилморфин (энзокрилгель), полистироллар (Био-Бидз S) асосида олинган полимерлар қўлланилади. Уларнинг барчаси сувли эритмаларда ажратиш учун қўлланилади.

Самарали ажратишнинг асосий омили

Ғовак гелда биомолекулаларнинг харакатида асосий омил деб биологик молекулаларнинг ўлчами ҳисобланади.

Декстран полисахаридини эпихлоргидрин билан ишлов берилганда, сефадекс деб номланадиган сувда эримайдиган, турли даражада намоён бўладиган кўндаланг чокларни хосил қилиб, йирик гидрофил доначаларни шаклланишига олиб келади.

Декстран полисахаридини эпихлоргидрин билан ишлов берилганда, сефадекс деб номланадиган сувда эримайдиган, турли даражада намоён бўладиган кўндаланг чокларни хосил қилиб, йирик гидрофил доначаларни шаклланишига олиб келади.

Сефадекслар заррачаларнинг ўлчами, ҳамда кўндаланг чоклар миқдори билан фарқ қиладилар, бу ўз навбатида юқори полимерни бўкиш даражасини белгилаб беради. Сефадексларнинг турли маркалари, унинг рақами кўрсатадиган бўкиш хусусиятлари билан фарқланади. Сефадекс рақами 1грамм қуруқ сефадекс сингдироладиган сувнинг ўн баробар ортиғини кўрсатади. Масалан, 1 грамм G-15 сефадекси 1,5мл, G-25 эса-2,5мл сувни сингдиролади.

Гель-фильтрацияда ажралиш схемаси

- Гель доналари
- Йирик молекулалар
- Кичик молекулалар
а
б
в

Услубнинг принципи:

Турли ўлчамдаги молекулаларни гелли колонкадан ўтишида йирик молекулалар тезроқ, кичик молекулалар эса секинроқ харакат қилади, чунки улар гранула ғовакларига кириб қолиши ҳисобига узинроқ йўлни босиб ўтади.

Охир оқибатда аралашма компонентларининг барчаси молекуляр оғирликларини камайиши тартибида гель доначалари билан тўлдирилган колонкадан элюция бўлади.

Тавсия этиладиган колонкалар ўлчами 1,8X20 см га тенг, ҳажми эса — 50,8 см3.

Бундай колонкани тўлдириш учун 50,8 : 5 = 10,16 г сефадекс керак бўлади.

Сефадексни тайёрлаш ва колонкани тўлдириш

Қуруқ сефадексни дистилланган сувнинг катта ҳажмида аралаштирилади (суспендирланади). Сефадекснинг асосий қисми чўккандан сўнг майда заррачаларни тутган чўкмаусти суюқликни олиб ташланади (декантацияланади). Бу амалиётни чўкмаусти суюқликни тиниқ ҳолга келмагунча такрорланади. Сефадексни ювиб, бўкиши учун юқоридаги жадвалда кўрсатилганидек хароратга кўра вақт сарфланади.

Колонкани тўлдириш

Колонка 20-25см узунликдаги, диаметри 1,8см бўлган шиша цилиндр идиш бўлиб, паст қисмида крани бор. Колонкани тубига шиша пахта солинади, устидан фильтр қоғозни ички ҳажм ўлчамида кесиб солинади. Сўнгра, колонкани 1/3 ҳажмини фосфат буфер (pH 6,8) билан тўлдирилади.

Ажратиш учун ашё

Гель-фильтрация учун лаборатория шароитида қон гемоглобини ва рибофлавин эритмаларининг аралашмаси олинади.

Реактивлар: а) рибофлавин, 0,02%-дистилланган сувдаги эритмаси; б) гемоглобин эритмаси.

Қонни дистилланган сувда 1:9 нисбатда эритилади; в) фосфат буфер (pH 6,8).

Ишнинг бориши:

• Сефадекс мувозанатга келтирилади. Бунинг учун колонкага кириш ва чиқиш соҳаларида муҳитнинг рНи бир ҳил бўлгунга қадар фосфат буфери билан ювилади.
• Сефадекс юзасини бузилмаслигини таъминлаган ҳолда хар иккала эритмани 2мл дан аралаштириб колонкага киритилади. Аралашма колонкани тўлдирганданг кейин, унинг юқори қисмига воронка ўрнатиб, ундан буферни тезлиги минутига 0,5млга тенглаштириб, фракциялар коллекторига хар бир пробирка 2мл тутиши таъминланиб, суюқлик йиғилади.

Аввалига гемоглобин тутадиган қизғиш (3-6 фракция), сўнгра оқиб чиқадиган эритманинг ранги сариққа ўзгариб, рибофлавин элюцияланишни бошлайди.

Гель-фильтрация ёрдамида юқоримолекуляр гемоглобин ва қуйимолекуляр рибофлавин аралашмаси ажралгандан сўнг, колонка ювилади, мувозанатлаштирилади, кейинги ажратиш учун тайёр бўлади.

Гель-фильтрация ёрдамида юқоримолекуляр гемоглобин ва қуйимолекуляр рибофлавин аралашмаси ажралгандан сўнг, колонка ювилади, мувозанатлаштирилади, кейинги ажратиш учун тайёр бўлади.

Эътиборингиз учун рахмат!

Эътиборингиз учун рахмат!